金黄色葡萄球菌的分离和初步鉴别
肉兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验
4522023肉兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验牛群孟庆福黄敏董旭陈小密王华*周孝琼*（龙岩学院生命科学学院福建龙岩364000）摘要为了诊断福建省龙岩市某兔场乳房炎的具体病原，试验对兔脓肿液进行细菌分离纯化培养、革兰氏染色、显微镜观察、自动微生物鉴定系统鉴定、16S rDNA序列测定以及对所分离菌株进行药敏试验和耐药性分析。
结果表明，所分离菌株为金黄色葡萄球菌。
药敏试验结果显示，分离的金黄色葡萄球菌对青霉素G、青霉素钾、氨苄西林、红霉素、庆大霉素和磺胺甲氧嘧啶高度敏感；对磺胺异亚唑中度敏感；对环丙沙星、卡那霉素、克林霉素等6种药物不敏感。
关键词肉兔金黄色葡萄球菌16S rDNA药敏试验文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）02-0017-04Isolation,identification and drug sensitivity test of Staphylococcus aureus from meat rabbitsNiu Qun Meng Qingfu Huang Min Dong Xu Chen Xiaomi Wang Hua*Zhou Xiaoqiong*(School of Life Sciences,Longyan University,Fujian Longyan364000)Abstract In order to diagnose the specific pathogen of mastitis in a rabbit farm in Longyan city,Fujian province,the experiment was conducted to isolate and purify the bacteria from rabbit abscess fluid,observe it with a Gram staining microscope,identify it with an automatic microbial identification system,determine the16S rDNA sequence,and analyze the drug sensitivity and drug resistance of the isolated strains.The results showed that the isolated strains were Staphylococcus aureus.The drug sensitivity test showed that the isolated strains were highly sensitive to penicillin G,penicillin potassium,ampicillin,erythromycin,gentamycin and sulfamethoxazole; moderately sensitive to sulfamethoxazole;It is insensitive to6drugs such as ciprofloxacin,kanamycin and clindamycin.Key words Meat rabbit Staphylococcus aureus16S rDNA Drug susceptibility test葡萄球菌病是由葡萄球菌属致病性葡萄球菌感染引起人和动物多种疾病的总称。
金黄色葡萄球菌检验
金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂 肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然 的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生 磷脂环。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
生物学特性 ——致 病 性
•金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取 决于其产生的毒素和侵袭性酶： •a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌 体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 •b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； •c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 •d.耐热核酸酶 •e.肠毒素：引起急性胃肠炎。
有毒性，并使菌落产生黑色
✓ 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环
✓ 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制 作用。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
在BP平板上典型菌落为：圆形,表面光滑、凸起、湿 润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽, 常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常 有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。
整理课件
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食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
•葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病， 可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突 出而且普遍，腹痛、腹泻次之。 •当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如 牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10 小时即可相当数量的肠毒素。
利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（最高可耐受 15%的氯化钠），用7.5%氯化钠肉汤增菌。
金葡球菌实验报告
一、实验目的通过本次实验，掌握金黄色葡萄球菌的分离、培养和鉴定方法，了解其生物学特性，为临床诊断和治疗提供依据。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株2. 培养基：普通琼脂、血琼脂、Baird-Parker培养基、营养肉汤3. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、移液器、试管、培养皿等4. 实验试剂：革兰氏染色液、碱性复红液、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甲基红等三、实验方法1. 菌株分离与纯化（1）将金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。
（2）取培养好的肉汤，用无菌移液器吸取适量接种于普通琼脂平板，37℃培养24小时。
（3）挑取单菌落，接种于血琼脂平板，37℃培养24小时。
（4）挑取单菌落，接种于Baird-Parker培养基平板，37℃培养24小时。
2. 鉴定试验（1）革兰氏染色：取纯化后的金黄色葡萄球菌，进行革兰氏染色，观察菌体形态。
（2）生化试验：进行触酶实验、葡萄糖发酵实验、麦芽糖发酵实验、乳糖发酵实验、蔗糖发酵实验、甲基红反应、VP反应等，以确定金黄色葡萄球菌的生化特性。
（3）溶血试验：观察金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的溶血情况。
（4）过氧化氢酶试验：观察金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上的过氧化氢酶反应。
四、实验结果1. 菌株分离与纯化在普通琼脂平板、血琼脂平板和Baird-Parker培养基平板上均分离出金黄色葡萄球菌，菌落呈圆形、凸起、表面光滑、湿润、不透明，产生黄色脂溶性色素。
2. 革兰氏染色金黄色葡萄球菌革兰氏染色阳性，呈球形，排列成葡萄串状。
3. 生化试验金黄色葡萄球菌触酶实验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、产酸不产气，甲基红反应阳性，VP反应阴性。
4. 溶血试验金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生溶血环。
5. 过氧化氢酶试验金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上产生黑色沉淀。
五、实验结论根据实验结果，分离出的金黄色葡萄球菌符合金黄色葡萄球菌的生物学特性，可以确认为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌的分离培养试验
实验金黄色葡萄球菌的分离培养一．实验目的；1．掌握Baird-Parker 培养基的配制方法2．掌握利用选择性培养基分离金黄色葡萄球菌的检验方法二．实验内容1 原理；Baird-Parker 培养基在含有氮源的基础上，补充了促进细菌生长的丙酮酸钠，又含有抑制剂：亚碲酸钾，故有较好的选择性。
但对于金葡萄球菌没有抑制，其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易于观察；加入卵黄，由于卵磷酯酶阳性特征，其菌落周围可出现明显的沉淀环。
利用选择性培养基进行常见致病菌的分离是致病菌检测中的重要部分。
2 仪器与试剂250ml 三角瓶灭菌锅量筒Baird-Parker 氏培养基、亚碲酸盐卵黄增菌液、7.5%氯化钠肉汤3 操作步骤3.1 培养基配制Baird-Parker琼脂培养板：称取58克干粉，加热溶解于950ml蒸馏水中,分装每瓶95ml, 121 C高压灭菌15分钟,冷至50C左右,于每95 ml加入常温解冻的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 ml ，摇匀后倾入无菌平皿。
7.5% 氯化钠肉汤（蛋白胨10g 牛肉膏5g 氯化钠75g 蒸馏水1000mlph7.4 ）将上述成分加热溶解，调节pH,分装，每瓶225 mL, 121 C高压灭菌15 min。
3.2 增菌及分离培养3.2.1挑取金黄色葡萄球菌接种于7.5%NaCI肉汤培养基内，置于（37C）恒温箱中培养6-8h.3.2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板，于36 C±1 C培养18 h〜24h 或45 h 〜48 h。
3.3 观察菌落形态4、结果判定根据菌落形态，鉴别检样中细菌种类三、实验结果实验金黄色葡萄球菌的染色镜检一．实验目的; 掌握细菌革兰氏染色方法；在显微镜下观察金黄色葡萄球菌的形态。
二．实验内容1 原理; 革兰氏阳性菌经结晶紫染色乙醇脱色后，仍为紫色，而革兰氏阴性菌被复染为其他颜色。
2 仪器与试剂；结晶紫染色液（结晶紫1g 95%乙醇20ml 1%草酸铵水溶液80ml 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
实验金黄色葡萄球菌的检验
实验金黄色葡萄球菌的检验实验5金黄色葡萄球菌的检验1目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA 酶。
3实验材料3.1检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。
3.3培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。
3.5仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。
4检样程序5操作步骤5.15.1.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。
若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
5.1.2增菌和分离培养将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。
金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
微生物金黄色葡萄球菌病例讨论
实验检测结果
1.菌落特点:菌落厚、有光泽、 圆形凸起，直径0.5~1.0mm。 血平板菌落周围形成透明的溶 血环。
2.血浆凝固酶试验和血溶现象： 血液凝固阳性，产生溶血环, 甘露醇发酵产酸。
3.实验确诊：病原体为金黄色
葡萄球菌。
菌落在培养基生长情况
致病物质与相关疾病
• 1)凝固酶（Coagulase）是能使含有抗凝剂的人 或兔血浆发生凝固的酶类物质。分为游离和结 合两种，与菌体逃避免疫，血栓形成有关。
• 2)溶血素（Staphyolysin）致病性葡萄球菌产 生溶血。重要致病物质，减毒后可做疫苗接种。
• 3)杀白细胞素（Leukocidin）含F和S两种蛋白 质，能杀死人和兔的多形核粒细胞和巨噬细胞。 此毒素有抗原性，不耐热，产生的抗体能阻止 葡萄球菌感染的复发。
致病物质与相关疾病
• 4）肠毒素（Enterotoxin）是引起食物中毒的
引起的全身感染
败血症
脓毒血症
中毒性休克综合征
引起的全身感染
食物中毒
烫伤样皮肤综合征
治疗与预防
谢谢 Question
致病物质，是一种蛋白质，耐热，对蛋白酶耐受， 可使人呕吐和腹泻，还是一种超抗原。
• 5）毒性休克综合毒素Ⅰ： 系噬菌体Ⅰ群金黄色 葡萄球菌产生。可引起发热，增加对内毒素的敏 感性。增强毛细血管通透性，引起必血管紊乱而 导致休克。
• 6）耐热核酸酶，对DAN或RNA有较强的降解能力， 有抗原性。
感染类型
微生物实验
病例讨论
Байду номын сангаас
病例简介
初步诊断
初步诊断
二.临床特征表现
初步诊断：细菌起的化脓性感染。
实验检测
金黄色葡萄球菌实训报告
一、实验目的1. 熟悉金黄色葡萄球菌的基本生物学特性。
2. 掌握金黄色葡萄球菌的分离、纯化及鉴定方法。
3. 了解金黄色葡萄球菌的致病性及防治措施。
二、实验原理金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于自然界和人类及动物体内。
该菌具有高度的致病性，可引起多种化脓性感染，如肺炎、败血症、心内膜炎等。
实验中，通过观察金黄色葡萄球菌的形态特征、生化反应和药物敏感性，实现对金黄色葡萄球菌的鉴定。
三、实验材料1. 金黄色葡萄球菌菌种：购自某生物技术公司。
2. 实验器材：显微镜、无菌操作台、接种环、接种针、无菌培养皿、营养琼脂、血液琼脂、药敏纸片、生理盐水、75%酒精、碘酒、显微镜油镜等。
3. 实验试剂：青霉素、红霉素、万古霉素、庆大霉素等药敏纸片。
四、实验方法1. 金黄色葡萄球菌的分离与纯化（1）接种：将金黄色葡萄球菌菌种接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。
（2）挑取单菌落：用接种环挑取生长良好的单菌落，接种于新的营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时。
（3）重复挑取：继续挑取单菌落，直至获得纯化后的金黄色葡萄球菌。
2. 金黄色葡萄球菌的形态特征观察（1）革兰氏染色：将纯化后的金黄色葡萄球菌涂片，进行革兰氏染色，显微镜下观察。
（2）菌落观察：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，37℃恒温培养24小时，观察菌落形态。
3. 金黄色葡萄球菌的生化反应鉴定（1）糖发酵实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于糖发酵培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生气泡。
（2）氧化酶实验：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于氧化酶培养基，37℃恒温培养24小时，观察是否产生颜色变化。
4. 金黄色葡萄球菌的药物敏感性实验（1）药敏纸片法：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于营养琼脂平板，将药敏纸片贴于平板表面，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。
（2）最低抑菌浓度（MIC）测定：将纯化后的金黄色葡萄球菌接种于微量肉汤稀释法培养基，分别加入不同浓度的药物，37℃恒温培养24小时，观察生长情况，确定最低抑菌浓度。
金黄色葡萄球菌检测实验报告
金黄色葡萄球菌检测实验报告一、实验目的金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，能够引起多种感染性疾病。
本次实验的目的是通过一系列的检测方法，准确检测出样本中是否存在金黄色葡萄球菌，并确定其数量和特性，为食品安全、临床诊断和环境卫生等领域提供可靠的检测依据。
二、实验原理金黄色葡萄球菌具有一些独特的生物学特性和生化反应，可通过以下几种方法进行检测：1、血浆凝固酶试验：金黄色葡萄球菌能够产生血浆凝固酶，使血浆发生凝固。
2、甘露醇发酵试验：金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇产酸。
3、革兰氏染色：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
三、实验材料1、样本：食品样本（如乳制品、肉类）、临床样本（如脓液、血液）等。
2、培养基和试剂：血琼脂平板甘露醇氯化钠琼脂培养基兔血浆革兰氏染色液生理盐水3、仪器设备：恒温培养箱显微镜无菌接种环、移液管等四、实验步骤1、样本处理食品样本：称取一定量的样品，加入适量生理盐水进行均质处理，制成稀释液。
临床样本：直接进行涂片或适当稀释。
2、增菌培养将处理后的样本接种于 75%氯化钠肉汤中，置于 36±1℃恒温培养箱中培养 18 24 小时。
3、分离培养从增菌培养物中分别划线接种于血琼脂平板和甘露醇氯化钠琼脂培养基上，于 36±1℃培养 18 24 小时。
4、形态观察观察血琼脂平板上的菌落形态，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色，周围有明显的透明溶血圈。
观察甘露醇氯化钠琼脂培养基上的菌落，金黄色葡萄球菌能使培养基变黄。
5、革兰氏染色挑取可疑菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
6、血浆凝固酶试验取兔血浆与可疑菌落混合，置于 36±1℃培养箱中观察，若血浆发生凝固，则为阳性。
7、甘露醇发酵试验接种可疑菌落于甘露醇氯化钠琼脂培养基中，观察是否产酸。
五、实验结果1、形态观察在血琼脂平板上观察到金黄色、周围有透明溶血圈的菌落。
在甘露醇氯化钠琼脂培养基上观察到变黄的菌落。
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品种名称：金黄色葡萄球菌显色培养基
品种编号：CRM012
英译名称：Chromogenic Staph. aureus Agar
金黄色葡萄球菌显色培养基用途：用于金黄色葡萄球菌的分离和初步鉴别。
金黄色葡萄球菌显色培养基使用原理：
蛋白胨、大豆胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化钠维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂;显色剂与金黄色葡萄球菌具有的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在无色透明平板上，金黄色葡萄球菌产生粉红-紫红的边缘整齐菌落;抑菌剂可抑制杂菌的生长。
操作步骤：
1、称取67.4g培养基干粉，加入1L蒸馏水或去离子水(可按比例扩大增或缩小)，搅拌加热煮沸至完全溶解(避免过度加热)，无需高压灭菌，冷至50℃左右倾注平板备用;
2、待检样品按照相应的标准(GB、SN、FDA等)进行取样及前增菌，挑取一环增菌液划线接种于制备好的该培养基平板上，于36±1℃培养18～24 h，观察结果，挑取典型可疑菌落进行鉴定试验。
结果判断：
菌属菌落特征
金黄色葡萄球菌粉红-紫红色菌落
其它菌蓝绿色或无色或受抑制
金黄色葡萄球菌显色培养基质量控制：
外观：流动性良好的淡黄色粉末，制备好的平板呈浅黄色透明固体培养基。
生物学：下列菌株接种后于36±1℃培养24h生长情况如下表：
质控菌菌落特征
金黄色葡萄球菌ATCC25923 生长良好，粉红-紫红色
单核增生李斯特菌ATCC19115 蓝绿色
表皮葡萄球菌(CMCC(B)26069 受抑制
粪肠球菌ATCC29212 受抑制
普通变形杆菌CMCC(B)49027 受抑制
规格：67.4克 /瓶，可配置1L的培养基。
贮存：
脱水培养基：2～8℃，在标签上注明的保质期内使用。
制备好平板：2～8℃，最多保存一周。