中华齿米虾胰蛋白酶基因的研究
中华锯齿米虾养殖水质管理
中华锯齿米虾养殖水质管理张元长;王国栋;谢仰杰;黄世玉【期刊名称】《科学养鱼》【年(卷),期】2018(000)012【总页数】2页(P85-86)【作者】张元长;王国栋;谢仰杰;黄世玉【作者单位】集美大学水产学院,福建厦门 361021;集美大学水产学院,福建厦门361021;农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门 361021;集美大学水产学院,福建厦门 361021;农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门 361021;集美大学水产学院,福建厦门 361021;农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021【正文语种】中文中华锯齿米虾(Neocaridinadenticulate)属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、匙指虾科、新米虾属。
该物种具有很强的环境适应能力，广泛分布于亚洲淡水水域，在形态和体色存在明显的地域差异性。
通过筛选红色突变体培育而成的樱花虾，自2003年开始成为水族爱好者的新宠，在观赏虾中占得一席之地。
此后又相继培育出极火虾、黄金米虾、香吉士、血腥玛丽虾、蓝丝绒虾和琉璃虾等十几个品系。
由于其色彩靓丽，易于饲养，深受爱好者青睐。
中华锯齿米虾除具有观赏价值外，还具有世代周期短、大型卵、成活率高等实验对象特点，是理想的科研材料。
笔者自2015年开始养殖中华锯齿米虾（为方便描述下文称为米虾）。
米虾养殖工作重点在于水质的控制。
这是一个工作量大，注意事项多的任务。
现总结水质管理经验，为广大米虾爱好者提供参考。
一、水温控制米虾最适宜的水温在20～25℃。
成体体长在2～3厘米，属于小型观赏虾，适合在玻璃缸内养殖。
对于室内养殖，水温比较好控制。
炎热夏季降温可以采用空调降温，但是特别注意的是水温不能按照空调显示的温度进行断定。
原因如下，第一冷气经过空气传播后，受到热空气的影响产生一定的耗损，并不能百分百到达水体中；第二当水体很大时，不同层面的水体温度有差别，笔者曾测量过大型水族箱不同位置的水温，其温差有1℃左右(其中包含设备产热导致的水温)。
中华锯齿米虾卵黄蛋白的纯化鉴定
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中华锯齿米虾卵黄蛋白的纯化鉴定
中华锯齿米虾卵黄蛋白的纯化鉴定穆淑梅;杨炎;孙世杰;康现江【摘要】为了研究中华锯齿米虾卵黄蛋白的性质,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用不同的染色方法对其进行分析鉴定,并采用电泳洗脱法从中华锯齿米虾成熟卵巢中将其分离纯化.研究结果表明,中华锯齿米虾成熟卵巢中的卵黄蛋白为糖脂复合蛋白,该蛋白分子质量为434 ku.利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析该卵黄蛋白由3个主要亚基组成,分子质量分别为108,89,78 ku.%In order to investigate the properties of vitellin (Vn),Vn from the matured ovaries of Neocaridina denticulata sinensis was purified by electroelution and characterized by native polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE), gradient PAGE and SDS-PAGE. The results indicated that Vn was a lipoglycop-rotein with a molecular mass of 434 ku and contained three major subunits (108 , 89 , 78 ku).【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(031)006【总页数】5页(P638-642)【关键词】中华锯齿米虾;卵黄蛋白;电泳洗脱;纯化;鉴定【作者】穆淑梅;杨炎;孙世杰;康现江【作者单位】河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002;华北制药金坦生物技术股份有限公司生物产品中心,河北石家庄050035;河北大学生命科学学院,河北保定071002;河北大学生命科学学院,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q959.223卵生动物中，卵黄生成是卵母细胞发育过程中的一个重要步骤，也是一个营养储备的过程，将蛋白质、脂肪、糖等营养物质储存到卵子中以备胚胎发育之需［1-2］.而卵子中卵黄的主要成分是卵黄蛋白（vitellin，Vn），因此，该蛋白的合成也就成为考察雌性动物生殖能力的一个很好的指标.雌性动物中，卵黄蛋白原（vitellogenin，Vg）是卵黄蛋白的前体，产生之后经由血淋巴运送到卵母细胞，经过一系列修饰及分解作用转化成卵黄蛋白，与卵黄蛋白有着免疫同一性［3］. 卵黄蛋白（原）通常仅存在于雌性动物中，但是现在也有其在雄性动物中出现的报道，这通常与动物的内分泌紊乱或环境激素引发的不良效应有关［2，4］.因此，卵黄蛋白（原）的存在也常用于研究激素参与的生殖调控［1］以及评估环境激素引发的不良生理效应［2，4-5］等方面.那么，在研究卵黄蛋白的合成以及激素（外源、内源）的调控（影响）作用之前，有必要对卵黄蛋白进行分离纯化和性质研究，为后续的抗体制备以及在此基础之上所做的上述研究提供基础资料.目前有关甲壳动物卵黄蛋白性质的研究国内外已有很多的报道，已经分离出日本对虾（Penaeus japonicus）［6］、斑节对虾（P.monodon）［7］、短沟对虾（P.semisulcatus）［8］、南美白对虾（P.vannamei）［8］、凡纳滨对虾（Litopenaeusmerguiensis）［9］、克氏原螯虾（Procambiusclarkii）［10］、红螯光壳螯虾（Cherax quadricarinatus）［11］、日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）［12］、罗氏沼虾（M.rosenbergii）［13］等种类的卵黄蛋白.卵黄蛋白的提纯方法主要有高效液相色谱仪法、密度梯度离心法、蔗糖-EDTA-硫酸铵沉淀法、凝胶过滤-阴离子交换层析法、电泳洗脱法等.本实验以中华锯齿米虾为实验材料，采用电泳洗脱法从其成熟卵巢中分离纯化卵黄蛋白，利用梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE分析卵黄蛋白的性质，为卵黄蛋白的合成等研究提供基础.1.1 材料实验所用中华锯齿米虾购自河北安新，产于白洋淀天然水体.选取卵巢发育成熟的中华锯齿米虾，冰浴条件下将其解剖，迅速取出卵巢备用.1.2 试剂天然高分子质量标准蛋白：Bovine serum albumin（67ku），Lactate dehydrogenase（140ku），Catalase（232ku），Ferritin（440ku），Thyroglobulin（669ku），Pharmaica.SDS-高分子质量标准蛋白：Glutamate dehydrogenase（53ku），Transferrin （76ku），β-Galactosidase（116ku），α-2-Macroglobulin（170ku），Myosin（220ku），Pharmaica.1.3 仪器JA2003电子天平，上海精科；Phs-3C酸度计，上海伟业仪器厂；Sigma 2-16K 高速冷冻离心机；DYY-Ⅲ6B恒流稳压电泳仪、DYC-Z24D电泳槽、DYC-Z40A 回收电泳槽，均为北京六一仪器厂产品；Uniscan B880扫描仪，清华紫光股份有限公司.1.4 方法1.4.1 卵巢粗提液的制备取中华锯齿米虾成熟卵巢，电子天平上称取0.5g，加入5mL预冷的蛋白提取液（0.5mol／L Tris-HCl，2mmol／L EDTA，0.1mol／L NaCl，0.1mmol／L PMSF，pH 7.4）匀浆.将匀浆液离心15min（4℃，10 000r／min），弃除上层油脂和下层沉淀，余者即为卵巢粗提液.1.4.2 卵黄蛋白的鉴定非变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析其卵巢粗提液，所用分离胶质量分数为6%，pH 8.9.电泳结束，将胶板纵向分为3部分，分别进行糖蛋白染色（过碘酸-Schiff's试剂），脂蛋白染色（苏丹黑B）以及考马斯亮蓝染色，分析蛋白性质［12］.1.4.3 电泳洗脱纯化卵黄蛋白成熟卵巢粗提液进行PAGE电泳（分离胶质量分数6%，pH 8.9）后，采用电泳洗脱法对其卵黄蛋白进行纯化［12］.1.4.4 电泳分析卵黄蛋白分子质量采用梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶质量分数4%～15%，pH 8.9）分析上述纯化卵黄蛋白的分子质量，加入天然高分子质量标准蛋白.1.4.5 电泳分析卵黄蛋白亚基性质SDS-PAGE（分离胶质量分数7%，pH 8.9）分析该卵黄蛋白亚基数目及分子质量.用还原样品缓冲液（含体积分数5% 的β-巯基乙醇和质量分数2% 的SDS）处理样品，加样前沸煮10min，同时加入SDS-高分子质量标准蛋白.2.1 卵黄蛋白的鉴定与纯化PAGE分析中华锯齿米虾成熟卵巢粗提液，结果显示考马斯亮蓝、糖蛋白、脂蛋白3种染色方法同时呈现阳性的蛋白带仅1条，而且迁移位置也一致（图1）.其他学者的研究结果证实，甲壳动物的卵黄蛋白为具有高分子质量的糖脂复合蛋白，所以可以确定本实验中的这条3种染色均为阳性的蛋白带即为中华锯齿米虾成熟卵巢中的卵黄蛋白.而在这条卵黄蛋白条带下方还有一条考马斯亮蓝深染的蛋白条带（图1a），但脂蛋白和糖蛋白染色均呈阴性（图1b，c），说明此蛋白非糖脂蛋白，同时证明染色鉴定卵黄蛋白的结果是可信的.此外，由于卵黄蛋白上结合有类胡萝卜素，所以在电泳过程中和电泳结束后，可在凝胶上看到一条较浅的橙黄色条带.这一结果与柳峰松等［14］的研究结果一致.将电泳洗脱纯化所得样品进行PAGE验证，考马斯亮蓝以及脂蛋白、糖蛋白特异染色结果均呈阳性（图2），说明纯化所得样品即为卵黄蛋白.2.2 卵黄蛋白及其亚基性质分析梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳分析已纯化的卵黄蛋白，根据标准蛋白曲线确定其分子质量为434ku（图3）.经SDS-PAGE分析，确定该蛋白由3个主要亚基组成，分子质量分别为108，89，78ku（图4）.目前对已经分离出的甲壳动物卵黄蛋白的研究一致认为，卵黄蛋白是一种高分子质量的糖脂蛋白，因此，本实验根据其这一特性，PAGE电泳后，通过糖蛋白、脂蛋白特异染色，对比考马斯亮蓝染色结果，分析确定了中华锯齿米虾成熟卵巢粗提液中的卵黄蛋白，随后采用电泳洗脱法对该蛋白进行了分离纯化.电泳洗脱法对于样品中含量丰富的蛋白（如甲壳动物成熟卵巢中的卵黄蛋白）的回收纯化是一种简便而快捷的方法，且提纯的蛋白纯度较高，比较适用于蛋白质的氨基酸组成分析、分子质量及亚基组成等性质分析的研究.实验中采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳以及SDS-PAGE的方法，分别分析了中华锯齿米虾成熟卵巢中卵黄蛋白的总分子质量及其亚基组成和各亚基分子质量.中华锯齿米虾成熟卵巢中存在1种卵黄蛋白，其分子质量为434ku，该蛋白由3个主要的亚基组成，分子质量分别为108，89，78ku.由结果可以看出，3个亚基分子质量之和与卵黄蛋白分子质量稍有差距，但是，这在关于甲壳动物卵黄蛋白的性质研究中是非常普遍的现象［6-13］，如谢松等［10］同样采用电泳回收的方法对克氏原螯虾的卵黄蛋白进行了纯化，聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分析其总分子质量为481ku，SDS-PAGE结果显示该蛋白具有6个亚基，分子质量分别为198，176，132，111，92，82ku.究其原因，可能与分析蛋白分子质量的方法有关.在已有的研究中，通常均采用SDSPAGE来分析各物种卵黄蛋白的亚基组成及分子质量［6-13］.SDS-PAGE分析蛋白分子质量的原理在于SDS所带的大量负电荷，消除或掩盖了与其结合的不同种类蛋白质间原有电荷的差异，从而利用分子质量差异将各种蛋白质分开.但是SDS-PAGE亦有不足之处，如对于带有较大辅基的蛋白（糖蛋白、脂蛋白等），由于它们的侧链会直接影响蛋白质与SDS结合后的形状，故不能确保电泳迁移率与蛋白分子质量的对数间的线性关系［15］.但由于SDS-PAGE检测简便快捷，所以仍是目前研究分析卵黄蛋白亚基分子质量的首选.研究甲壳动物卵黄蛋白，最终目的是要了解其合成积累机理，对卵黄蛋白的纯化鉴定则是这一工作的前提.通过分离纯化卵黄蛋白来制备其特异性抗体，由于卵黄蛋白与其前体卵黄蛋白原具有免疫同一性，该抗体可用以检测卵黄蛋白原的发生以及卵黄蛋白的积累部位，探讨其合成机理，了解相关激素的内分泌调控机制，为在养殖过程中实现亲本促熟提供科学依据.【相关文献】［1］TSUKIMURA B.Crustacean vitellogenesis：its role in oocyte development［J］.American Zoologist，2001，41：465-476.［2］SHECHTER A，AFLALO E D，DAVIS C，et al.Expression of the reproductive female-specific vitellogenin gene in endocrinologically induced male and intersex Cheraxquadricarinatus crayfish［J］.Biology of Reproduction，2005，73：72-79.［3］AVARRE J C，MICHELIS R，TIETZ A，et al.Relationship between vitellogenin and vitellin in a marine shrimp（Penaeussemisulcatus）and molecular characterization of vitellogenin complementary DNAs［J］.Biology of Reproduction，2003，69（1）：355-364.［4］COCCIA E，LISA E D，CRISTO C D，et al.Effects of estradiol and progesterone onthe reproduction of the freshwater crayfish Cheraxalbidus［J］.Biological Bulletin，2010，218：36-47.［5］SPANÒL，TYLER C R，VAN AERLE R，et al.Effects of atrazine on sex steroid dynamics，plasma vitellogenin concentration and gonad development in adult goldfish（Carassiusauratus）［J］.Aquatic toxicology，2004，66：369-379.［6］KAWAZOE I C，JASMANI S A，SHIH T U，et al.Purification and characterization of vitellin from the ovary of kuruma prawn，Penaeusjaponicus［J］.Fisheries Science，2000，66：390-396.［7］QUINTIO E T，HARA A，YAMAUCHI K，et al.Isolation and characterization of vitellin from the ovary of Penaeus monodon［J］.Invertebrate Reproduction ＆ Development，1990，17（3）：221-227.［8］TOM M，FINGERMAN M，HAYES T K，et al.A comparative study of the ovarian proteins from two penaeus shrimp，Penaeussemisulcatus de Hann and Penaeusvannamei （Boone）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B，1992，102（3）：483-490.［9］AUTTARAT J，PHIRIYANGKUL P，UTARABHAND P.Characterization of vitellin from the ovaries of the banana shrimp Litopenaeusmerguiensis［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B，2006，143：27-36.［10］谢松，安建宏，梁晓辉，等.克氏原螯虾（Procambiusclarkii）卵黄蛋白的部分生化性质［J］.河北大学学报：自然科学版，2006，26（2）：199-202.［11］李荷迪，周忠良，赵云龙.红螯光壳螯虾卵黄磷蛋白的分离纯化和鉴定［J］.动物学杂志，2004，39（3）：17-21.［12］穆淑梅，康现江，李彦芹，等.日本沼虾卵黄磷蛋白生化性质分析［J］.河北农业大学学报，2006，29（5）：72-75.［13］CHEN Y N，KUO C M.Purification and characterization of vitellin from the freshwater giant prawn，Macrobranchium rosenbergii［J］.Zoological Studies，1998，37（2）：126-136.［14］柳峰松，武金霞，谢松，等.成熟中国对虾Penaeuschinensis卵巢中卵黄蛋白的纯化［J］.河北大学学报：自然科学版，2001，21（4）：406-410.［15］李建武，余瑞元，袁明秀，等.生物化学实验原理和方法［M］.北京：北京大学出版社，2001.。
观赏中华锯齿米虾的培育与养殖研究进展
观赏中华锯齿米虾的培育与养殖研究进展
邓杰文;陈婉怡
【期刊名称】《乡村科技》
【年(卷),期】2022(13)18
【摘要】近年来,中华锯齿米虾逐渐成为水族爱好者的新宠。
中华锯齿米虾不仅颜色多样,观赏性极佳,还能控制水族缸中藻类的数量。
基于此,探究中华锯齿米虾的培育与养殖研究进展,并指出目前该领域相关理论与实践经验的空缺,为中华锯齿米虾的培育与养殖提供更多参考。
【总页数】4页(P80-83)
【作者】邓杰文;陈婉怡
【作者单位】华南师范大学
【正文语种】中文
【中图分类】S917.4
【相关文献】
1.中华锯齿米虾卵巢发育过程中卵黄蛋白积累的研究
2.观赏锯齿新米虾主要体色品系的由来及培育方法
3.观赏中华锯齿米虾的基础生物学和繁养技术
4.中华锯齿米虾养殖水质管理
5.紫外线照射对中华锯齿米虾胚胎发育的影响
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中华锯齿米虾性腺发育与生殖细胞发生的开题报告
中华锯齿米虾性腺发育与生殖细胞发生的开题报告题目：中华锯齿米虾性腺发育与生殖细胞发生的研究一、研究背景中华锯齿米虾是一种重要的经济水产品，其生殖细胞的发育和生殖周期的研究对于生产性状的改良和培育优质育种具有重要意义。
由于生殖细胞在生殖过程中经历了多个发育阶段，且受到环境因素和遗传因素的影响，因此对中华锯齿米虾生殖细胞发生过程的深入研究至关重要。
二、研究目的本研究的目的是通过研究中华锯齿米虾性腺的发育过程和生殖细胞的发生规律，探讨其生殖细胞的发育与生殖周期的关系，为中华锯齿米虾的育种和种质资源的利用提供科学依据。
三、研究内容1. 中华锯齿米虾性腺的形态结构及发育过程的观察2. 中华锯齿米虾生殖细胞的类型及其发生规律的研究3. 中华锯齿米虾不同发育阶段的生殖细胞形态特征的描述4. 中华锯齿米虾生殖细胞与生殖周期的关系的分析四、研究方法1. 中华锯齿米虾性腺的解剖和组织切片技术2. 静态和动态组织切割技术研究中华锯齿米虾生殖细胞的发生规律3. 光学显微镜、电子显微镜等技术研究中华锯齿米虾生殖细胞的形态特征4. 生殖周期的仿真、实验和统计分析方法。
五、研究意义1. 通过研究中华锯齿米虾的生殖细胞发生规律，能更好地了解其繁殖方式，为中华锯齿米虾的养殖和生产提供科学依据。
2. 通过研究中华锯齿米虾的生殖细胞发生注意事项，能够有效地防止其在养殖过程中的繁殖问题。
3. 通过研究中华锯齿米虾的生殖细胞发生的规律和周期，有助于建立更加科学的中华锯齿米虾种质资源保护和育种技术体系。
六、研究难点1. 中华锯齿米虾生殖细胞类型的鉴定与分类。
2. 中华锯齿米虾生殖细胞形态特征的描述与分析。
3. 中华锯齿米虾生殖细胞发生规律与发生周期的研究。
七、研究预期结果1. 描述中华锯齿米虾生殖细胞的形态特征和发生规律。
2. 普及中华锯齿米虾生殖细胞的发育和生殖知识。
3. 建立中华锯齿米虾种质资源保护和育种技术体系。
四、研究进展和不足目前该研究进展良好，但还存在着许多问题。
中华锯齿米虾卵巢发育过程中卵黄蛋白积累的研究
泳洗脱法从其成熟卵巢中获得卵黄蛋白!6GUY::GE%6E"%制 备 多 抗%进 行 双 向 免 疫 扩 散 和 免 疫 印 迹 试 验%结 果 显
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虾蟹类摄食行为的研究
摄食是动物的基本生命活动，是其获取营养物质的方式。
鱼虾的摄食行为是其摄食习性的行动表现，是由食欲、激发、探究、吞咽(或吐出)、饱食、饥饿的连锁反应才得以完成的，并且受神经系统控制。
环境和食物是影响虾蟹类摄食行为的重要因素。
目前在虾蟹类的养殖中饵料的利用率较低，这不仅对生物资源造成巨大浪费，同时也对环境造成严重的污染。
饵料利用率低是养殖过程中饲料、配制、加工、投喂和管理等环节存在许多不合理因素导致的。
因此，研究虾蟹类的摄食行为，对于指导虾蟹类生产养殖具有重要意义。
1 虾蟹类食性明确养殖对象的食性是水产养殖过程中重要环节。
虾蟹类食性的研究方法主要有：胃含物分析法；稳定性同位素分析技术；消化酶活性法等。
胃含物分析法是虾蟹类食性研究最主要的技术，主要通过分析天然或养殖环境中动物的胃或前肠内含物成分来分析动物食性。
最早有学者利用胃含物分析法在对虾中进行了食谱研究，结果发现对虾的食谱非常广（微生物、植物和动物都存在）。
类似的，利用稳定同位素分析技术分析了天然或养殖环境中动物体内的碳、氮、氢等的稳定同位素含量与环境中生物或有机成分的相应同位素含量的关系对虾蟹类的食性分析也表明对虾的食谱非常广泛。
除了以上两种方法，有些学者利用虾蟹各种消化酶活性来判断它们的食性，通过蛋白酶和淀粉酶活性的比值大小将对虾划分为肉食性和植食性。
大量研究都发现对虾的食谱非常广，因此，一般认为对虾是杂食性的生物。
但是综合胃含物比例和消化酶活性来看，对虾的食性还是偏向于肉食性。
类似的,在中华绒螯蟹的胃内容物中同时发现藻类、植物碎屑、枝角类、虾及鱼。
梭子蟹的研究中发现其胃中内含物有三十多种。
许多学者把青蟹归为肉食性动物，但是在其消化道中也发现了植物组织的存在。
基于以上研究，虾蟹类的食性应该为杂食偏肉食性。
有学者认为，在自然或者池塘中的虾蟹消化道中存在多种动植物是由环境所影响的。
由于环境中饵料组成和丰度会随着时间变化发生较大的波动，所以很多时候虾蟹类只能摄入自己不喜欢的食物以维持生长。
3种不同虾类虾头中酶的筛选
3种不同虾类虾头中酶的筛选吴燕燕;王萍;李来好;杨贤庆;刁石强【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)014【摘要】以凡纳滨对虾、罗氏沼虾、斑节对虾的加工下脚料——虾头为原料,通过酶的提取、酶活测定及酶含量的分析,对这3种虾类虾头中的蛋白酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、多酚氧化酶等酶类进行筛选和评价.结果表明:3种虾类的虾头中凡纳滨对虾虾头的蛋白酶酶活力为39615.8(±3 108.4)U/gprot,约为其他2种虾的2倍；而罗氏沼虾虾头的碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶具有较高活性,斑节对虾虾头的乙酰胆碱酯酶含量较高,在3种虾类的虾头中均未检测到溶菌酶.【总页数】4页(P116-119)【作者】吴燕燕;王萍;李来好;杨贤庆;刁石强【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;上海海洋大学食品学院,上海201306;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300【正文语种】中文【中图分类】Q814.1【相关文献】1.3种虾类超氧化物歧化酶同工酶比较 [J], 雷晓柱;刘存歧;王伟伟;张亚娟;王军霞2.3种虾类超氧化物歧化酶同工酶比较 [J], 雷晓柱;刘存歧;王伟伟;张亚娟;王军霞3.天津地区主产虾类多酚氧化酶抑制剂的筛选及应用 [J], 梁美艳;陈庆森;黄秋轶;刘勤生;柴春祥4.适于烟草生物反应器的真核生物源虾青素合成酶筛选 [J], 方宁;王春凯;刘晓峰;赵雪;刘艳华;刘新民;杜咏梅;张忠锋;张洪博5.不同碳氮比对生物絮团形成及对日本沼虾生长、抗氧化酶和消化酶的影响 [J], 金毅;钱珺;张禹宁;傅洪拓;孙盛明;乔慧;张文宜;金舒博;龚永生;蒋速飞;熊贻伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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中华齿米虾胰蛋白酶基因的研究张建业1,2,姜国良1,王 宁1,马欣荣1(1.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛2660032.中国科学院海洋研究所,山东青岛266071)摘要:以中华齿米虾(N eocari dina denticulata sinensis)基因组DNA为模板,根据胰蛋白酶基因保守序列设计简并引物,利用PCR技术获得一个基因。
序列分析表明此基因与已报道的凡纳滨对虾(L itopenaeus vannamei)胰蛋白酶基因有较高的相似度,序列中包含一个内含子和两个不完整的外显子,编码182个氨基酸残基。
该氨基酸序列与凡纳滨对虾胰蛋白酶氨基酸序列的相似度为83.5%;含有胰蛋白酶所特有的His、Asp和Ser组成的活性三联体、决定胰蛋白酶底物专一性的Asp、底物结合部位的G1y残基。
综合分析认定该基因为胰蛋白酶基因片断。
将其氨基酸序列与报道的其他动物胰蛋白酶氨基酸序列进行了系统进化分析。
系统进化分析的结果与现有以表型特征为依据的虾分类结果是一致的。
关键词:中华齿米虾(N eocari dina denticulata sinensis);胰蛋白酶;基因;系统进化分析中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:100023096(2007)022******* 近年来,国外学者针对甲壳动物基因,其中主要是经济类甲壳动物如虾、蟹及非经济类的卤虫(A rtemia)基因开展了细致的研究工作,分离鉴定了约30多种功能基因。
而国内在这方面的工作比较薄弱[1]。
胰蛋白酶是甲壳动物体内最丰富的一种蛋白水解酶,在甲壳动物的食物消化中起着重要的作用。
目前凡纳滨对虾胰蛋白酶及其基因的研究已经较为详尽[2]。
但是其他甲壳动物胰蛋白酶基因研究的很少。
中华齿米虾(N eocari dina denticulata sinensis)属于一种经济虾,常在农村的集市上出售,也是肉食性鱼类的重要饵料。
作者旨在克隆中华齿米虾胰蛋白酶基因,了解其基因结构,为将来表达胰蛋白酶基因并将之应用于生产提供资料。
1 材料与方法1.1 材料中华齿米虾购自青岛南山水产品市场,购回后立即清洗干净,取其尾节肌肉,称量后冻存于液氮中备用。
DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技术发展中心;DNA Marker DL2000、PMD182T 载体和限制性内切酶购自日本Takara公司;Taq DNA聚合酶、dN TP等购自上海生工生物工程技术服务有限公司;其余药品及试剂均为进口和国产分析纯。
PTC2100型PCR仪为美国Mjresearch.Inc 公司产品。
1.2 方法1.2.1 中华齿米虾基因组DNA的提取中华齿米虾基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》[3](略有改动)。
1.2.2 中华齿米虾胰蛋白酶基因保守片段的PCR扩增根据G enebank中已报道的部分水生动物凡纳滨对虾(L itopenaeus vannamei),堪察加蟹(Kam2 chatka crab),红色帝王蟹(Paralithodes camtschatic2 us),螯虾(Paci f astacus leni uscul us),海产七鳃鳗(Pet rom y z on marinus)和日本凤尾鱼(Eng raulis j a2 ponicus)等胰蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,找到两处保守域,设计出一对简并性引物:上游引物:5’CT TCT GCGGM GC YTCCA TCTA2CA3’下游引物:5’RT ARCCCCA GG ASACRATG CC3’其中,M:C/A;Y:C/T;R:G/A;S:C/G。
PCR反应体系:DNA模扳1μL,dN TP(10 mmol/L)1μL,10×PCR buffer5μL,MgCl2(25 mmol/L)4μL,上、下游引物(10mm ol/L)各1μL,T aq 酶(5U/μL)1μL,补加ddH2O到50μL。
石蜡油封口。
PCR反应程序:预变性94℃,5min,变性94℃,40s;退火50℃,40s;延伸72℃,60s,共循环35次,充分延伸72℃,10min。
收稿日期:2005205222;修回日期:2005211210作者简介:张建业(19712),男,山西兴县人,博士后,讲师,E2 mail:jyzhang2008@;姜国良,通讯作者,E2 mail:gljiang@1.2.3 PCR 产物的回收及连接PCR 产物的回收及连接按试剂说明书进行。
1.2.4 质粒转化、筛选及酶切检测参照《分子克隆实验指南》[2]。
1.2.5 克隆基因测序及序列分析克隆基因由上海生工测序。
利用NCBI 的Blast ,Clustal x 1.8,DNA Tools 和DNAStar 软件包进行结构、功能、同源性和系统进化分析。
2 结果与讨论2.1 中华齿米虾胰蛋白酶基因的克隆根据所设计的简并性PCR 引物,直接扩增中华齿米虾基因组DNA ,所得到的PCR 产物电泳结果如图1所示。
扩增产物为一条清晰的亮带,分子量大小约为700bp。
图1 中华齿米虾胰蛋白酶基因片段PCR 结果电泳检测Fig.1 The result of t he trypsin gene fragment s am 2plified from t he genomic DNA of N eocari dinadenticulata sinensisM 1:Lambda DNA/Eco R Ⅰ+Hind ⅢMarker ;1:基因组DNA ;2:简并性PCR 产物,分子量约700bp ;M 2:DL2000MarkerM 1:Lambda DNA/EcoR Ⅰ+Hind ⅢMarker ;1:genomicDNA ;2:degenerate PCR p roduct ;M 2:DL2000Marker2.2 酶切重组质粒电泳检测对提取的重组质粒DNA 进行EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切、Hind Ⅲ单酶切并与经Hind Ⅲ单酶切之PUC 219质粒DNA 同时进行电泳,比较检测插入外源片段。
结果显示,双酶切后的两个片段中小片段的大小约为700bp ,恰为目的基因的长度;剩余大片段的长度短于单酶切后的重组质粒,与线性化的PUC 219相当,证明外援片段插入成功,见图2。
图2 重组质粒DNA 酶切检测外源片段结果Fig.2 Electrophoresis of recombinant plasmids digestedwit h Ecor Ⅰ+Himd ⅢM 2:DL2000Marker ;1:PUC 219质粒单酶切;2:重组质粒单酶切;3:重组质粒双酶切M 2:DL2000Marker ;1:PUC 219plasmids/Himd Ⅲ;2:recombi 2nant plasmids/Himd Ⅲ;3:recombinant plasmids/Eco R Ⅰ+Himd Ⅲ2.3 中华齿米虾胰蛋白酶基因序列分析测序结果显示,片段大小672bp ,去除PCR 引物序列后长度为629bp 。
运用“GT 2A G 法则”分析发现序列中含有一个内含子,位于94～216个核苷酸处,长度122bp ;同时具有两个不完整的外显子区,分别为1～94和217～672。
利用DNA Tools 软件进行分析得到一条长度为182个氨基酸残基的推断胰蛋白酶肽段,见图3。
2.4 序列比对分析发现克隆的基因与凡纳滨对虾胰蛋白酶核苷酸序列较高的一致度(61.2%)。
推断出的氨基酸序列一致度为83.5%,与三文鱼虱,鸡,牛以及人的胰蛋白酶蛋白质序列均有一定的相似度,分别为41.8%,33.0%,35.7%和37.9%。
胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,推断的氨基酸序列具有丝氨酸蛋白酶的保守序列[4]:(1)活性位点:含有在所有丝氨酸蛋白酶中都有的His (17)、Asp (68)和Ser (161)活性三联体。
(2)底物结合位点:Asp (155),该残基位于底物结合沟的底部,并通过电荷作用而稳定底物裂解位点的Lys 或Arq 残基,因而也决定着胰蛋白酶的专一图3 中华齿米虾胰蛋白酶基因序列Fig.3 The sequence of trypsin of N eocari dina denticulata sinensis序列大小为672bp ,其中划线部分为设计的简并性PCR 引物,去除引物部分后的序列全长为629bp 。
方框内序列为内含子区域,位于94～216个核苷酸处,长度122bp ;外显子区域位于内含子两端,编码长度为182个氨基酸残基的胰蛋白酶肽段The sequence is 672bp nucleotide 。
Degenerate PCR p rimers are underlined.The sequence without these two primers is 629bp.The se 2quence in frame is the site of intron (94～216)and it s lengt h is 122bp ;The two ext rons lie in both sides of the intron and they encode a peptide of Tryp sin which includes 182amino acids性(5)。
(3)催化位点:在催化位点附近的Ala 、G ly 、Asp 、Ser 等也都是保守的,其中保守度最高的是157位～164位胰蛋白酶催化位点所在的保守模体(mo 2tif ),所有在本文中涉及到的物种胰蛋白酶在此部位均无变异。
(4)含有5个在其他物种中都高度保守的Cys ,它们分别是Cys 2、Cys 18、Cys 131、Cys 146和Cys 157,可形成两个以上的二硫键。
可进一步断定本实验所克隆得到的片段确为甲壳动物胰蛋白酶基因的一部分序列。
同时,作者也发现其胰蛋白酶氨基酸序列与昆虫类的相似度则较低,以果蝇为例仅为24.2%。
推断其中原因,可能恰恰正是物种在进化过程中分化早晚的一种体现;也可能是由于它们生存环境尤其是食性差异所致,而其正确答案尚需进一步研究加以解释。
2.5 系统进化分析利用MegAlign 软件,将推断出的中华齿米虾胰蛋白酶氨基酸序列与G eneBank 中已报到的11种代表性物种胰蛋白酶序列绘制系统进化树(图4)。
系统进化分析的结果能够反映各种甲壳动物的分类地位与进化上的关系:首先是甲壳动物与昆虫这两种节肢动物的最先分化,然后依次分化出了软骨鱼、硬骨鱼、两栖类和鸟类,最终分化出了哺乳动物。
而在甲壳动物中则是挠足类动物最先分化出来,然后才是口足目与十足目的分化,最后是十足目内的分化。