人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化
人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化作者：余厚友宋祖军袁顺书刘彦仿杨守京【关键词】肝肿瘤关键词: 肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达摘要:目的克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能. 方法从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中，用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE 电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot 鉴定. 结果克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr 为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白. 结论克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.Keywords:liver neoplasms;cell line;heat shock protein72;cloning;gene expressionAbstract:AIM To clone human heat shock protein72（HSP72）gene，do prokaryotic expression and purify HSP72protein for furtherstudy.METHODS Human HSP72gene was obtained by RT-PCR from heat shocked human hepato-carcinoma cell line SMMC-7721.Its product was recombined in vitro with prokaryotic expression vector pQE-30and was transformed to E.coli strain JM109.The proteins，expressed in E.coli strain with HSP72recombinant plasmid under IPTG induction，was obtained by FPLC and Sephacryl S200chro-matography and characterized by SDS-PAGE and Western-blot-confirmed with anti-HSP72McAb.RESULTS The HSP72gene was cloned and identified to be consistent with relevant reports.The HSP72with a molecular weight of72000was highly expressed in pQE-30HSP72.Western blot proved that the expressed product had the antigenicity of HSP72.CONCLUSION The establishment of a series of methods for the cloning，expression and purification of HSP72gene will assist in the structural and functional char-acterization of HSP72.0 引言热休克蛋白（HSP）是生物体（或离体的培养细胞）在不良环境因素作用下（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等）所产生的一组特殊蛋白质，对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛，在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用，属分子伴侣蛋白［1］ .热休克蛋白72（HSP72）是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关，有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因，并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达，建立了一套完备的纯化方法，为进一步研究提供了条件.1 材料和方法1.1 材料人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoR I，Pst I，T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自NSBC Sangon公司.DNA Marker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.1.2 方法1.2.1 PCR引物的设计根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列，设计了一对PCR扩增引物，并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的新的酶切位点EcoR I和Pst I以便于基因的酶切和定向克隆.P1:5’cggattcATGGCCAAAGC-CGCGGCG3’;P2:5’cgctcgagATCTACCTCCT-CAATGGT3’.1.2.2 人HSP72基因的扩增人肝癌细胞株SMMC-7721经42℃热休克2h，于休克后16h［2］根据试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，以其为模板PCR扩增HSP72目的片段.反应条件:去离子水37μL，cDNA1μL，引物各1μL，10×buffer5μL，25mmol・L-1 dNTP1μL，10mmol・L-1 MgCl2 3μL，混匀，94℃变性5min，冰浴1min后，加入Taq DNA聚合酶1μL.PCR 仪扩增，反应参数:先95℃预变性5min，然后按94℃1min，55℃1min，72℃2min的条件进行35个循环，最后72℃延伸10min.1.2.3 HSP72基因的克隆与测序经PCR扩增后，扩增产物在10g・L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定.将质粒pUC19和目的片段经EcoR I和Pst I双酶切，回收载体和目的片段，在T4DNA连接酶作用下12℃过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后行全基因的全自动序列分析.1.2.4 HSP72基因的原核表达从经测序鉴定后的pUC19-HSP72中EcoR I和Pst I双酶切回收HSP72目的基因片段，并与经同样限制酶双酶切的原核表达质粒pQE-30相连接，建立原核表达载体pQE-30HSP72，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切鉴定后将含有表达载体的单一菌落在LB培养基（含100mg・L-1 氨苄青霉素）中过夜培养，然后转接至新的10g・L-1 LB肉汤管（含2g・L-1 葡萄糖、100mg・L-1 氨苄青霉素）中，继续培养至A值约为0.4～0.6，37℃加诱导剂IPTG至终浓度为1mmol・L-1 ，取诱导0，0.5，1，2，3和4h各组样品，SDS-PAGE检测表达产物，并用anti-HSP72单抗作Western blot鉴定其抗原性［3］ .1.2.5 HSP72蛋白的纯化和鉴定pQE-30HSP72转化的JM109菌经培养和IPTG诱导表达后，12000g离心5min收集沉淀、经30mmol・L-1 NaHCO3（pH7.4）溶液4℃低渗30min，12000g离心15min 取上清，PEG20000浓缩后过FPLC离子交换柱［4］，梯度洗脱，收集峰值蛋白液;浓缩后分别过Sephacryl S200凝胶柱，收集峰值蛋白液;纯化蛋白液分别用SDS-PAGE检测相对分子质量，并用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定其抗原性.2 结果2.1 人HSP72基因的克隆与测序经PCR扩增后，扩增产物在10g・L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定结果表明，从人肝癌细胞株SMMC-7721扩增得到了长度约1.9kb的DNA片段（Fig1）.克隆基因的全自动序列分析结果与GeneBank所报道的人HSP72基因序列相一致.图1 重组pQE-30HSP72载体DNA酶切后电泳图略2.2 重组原核表达载体的构建与鉴定重组原核表达载体pQE-30HSP72转化大肠杆菌JM109后，经质粒提取和10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，用EcoR I酶切的A组，在5400bp处有一条带，经EcoR I和Pst I双酶切的B组，在1900bp处和3500bp 处各有一条带（Fig1）. 2.3 pQE┐30HSP72表达产物的检测重组pQE-30HSP72转化的大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE检测对照、实验组0h均无明显表达，实验组0.5，1，2，3和4h各组可见在Mr 72000处有一蛋白带，随时间延长表达产物增多，2h时最多（Fig2）.用Western blot法检测抗原可见在Mr 72000处有一与anti-HSP72单抗结合带，随时间延长而加深.2.4 纯化蛋白的鉴定经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化的蛋白，经SDS-PAGE检测在Mr 72000处有一条带，用anti-HSP72单抗行Western blot鉴定在Mr 72000处有一抗体结合带（Fig3）.图2 －图3 略3 讨论HSP72是HSP70家族的主要成员，是热休克蛋白73（HSP73）的类似蛋白，HSP73主要呈结构性表达于几乎所有细胞，而在哺乳动物中正常情况下很难测出HSP72，但在应激反应状态下HSP72会大量合成［5］ .两者不仅相对分子质量相似，其结构、功能及生物学特性也相似.此外，HSP72还具有HSP73所不具有的、尤其是与应激相关的一些功能，如在变性蛋白聚集体的折叠及溶解过程中的“分子伴侣”作用，参与应激时产生的不可逆变性蛋白的转位等［6］ .尽管对HSP72的研究一直很热门，对其作用机制仍知之甚少.现已知HSP72有两个结构域:N末端有一腺苷酸结合区，具有微弱的ATP酶活性，C末端存在基质识别区，可与短的多肽非共价结合［7］ .近年来发现HSP72蛋白与自身免疫性疾病、缺血性疾病、癫痫及各类肿瘤等疾病有密切联系［8］，因而，对其做深入研究很有必要.我们所用pQE-30是含有T7启动子、终止子和抗Amp基因等的高表达原核载体.HSP72基因全长约1900bp，重组的基因图长约5400bp.JM109菌株是Amp（―）菌株，当重组载体转入后，由于含有抗Amp基因，转化的细菌就能在Amp（+）的琼脂平板上生长.从转化菌中提取的质粒，经单独酶切得到的5400bp基因片段与重组载体长度一致，经双酶切得到的3500bp 片段为pQE-30的基因，另一1900bp基因片段为人HSP72基因，因此重组载体的构建与设想一致.本结果显示，转化菌株在IPTG的诱导下能产生Mr 为72000的蛋白，且随时间延长表达产物明显增多.用anti-HSP72单抗Western blot法检测证明，该蛋白具有HSP72抗原特异性，因而该转化菌株表达产物为HSP72.而转入pQE-30的对照组无明显表达Mr 70000的蛋白，也不随诱导时间延长而变化.取诱导2h后的细菌低渗裂解液，经FPLC分离后共获8个蛋白洗脱峰，其中第3，5峰洗脱液中富含HSP72蛋白，但尚含有较多的Mr <60000的其他蛋白，此两峰蛋白样品经Sephacryl S200进一步分离，电泳结果表明，获得纯度较高的M r 为70000的目的蛋白Western blot进一步证实为HSP72.为进一步研究HSP72的结构和功能及临床应用奠定了基础.参考文献:［1］Morimoto RI，Tissieres A，Ceorgopoulos C.The stress re-sponse，function of the proteins，and perspective ［A］.In:Mo-rimoto RI，Tissieres A，Gergopoulos C.Stress proteins in biolo-gy and medicine ［M］.New York:Cold Spring Harbor Labora-tory Press，1990:175-198.［2］Zhang SZ，Wang XP，Liu YF，Yang SJ.Expression of heat shock protein70in human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（9）:1164.精选 doc 可编辑［3］Sambrook J，Fritch EF，Maniatis T.Molecular cloning:A labo-ratory manual ［M］.2nd ed.New York:CSH，1989:852-904.［4］Udono H，Srivastava PK.Heat shock protein associated pep-tides elicit specific cancer immunity ［J］.J Exp Med，1993;178:1391-1396.［5］Gething MJ，Sambrook J.Protein folding in the cell ［J］.Na-ture，1992;355:33-45.［6］Dastoor Z，Dreyer J.Nuclear translocation and aggregate forma-tion of heat shock cognate protein70（Hsc70）in oxidative stress and apoptosis ［J］.J Cell Sci，2000;113（Pt16）:2845-2854.［7］Welch WJ.The mammalian stress response:Cell physiology and biochemistry of stress proteins ［A］.In:Morimoto RI，Tissieres A，Gergopoulos C.Stress proteins in biology and medicine ［M］.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990:223-278.［8］Beere HM，Wolf BB，Cain K，Mosser DD，Mahboubi A，Kuwana T.Heat-shock protein70inhibits apoptosis by pre-venting recruitment of procaspase-9to the Apaf-1apoptosome ［J］.Nat Cell Biol，2000;2（8）:469-475.word欢迎下载。
人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化
人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化李航宇;傅庆国;孔凡民;隋春阳;翟振华;孙宏治;刘金钢;郭仁宣【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2005(034)006【摘要】目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.【总页数】3页(P564-565,568)【作者】李航宇;傅庆国;孔凡民;隋春阳;翟振华;孙宏治;刘金钢;郭仁宣【作者单位】中国医科大学附属第二医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院肿瘤科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第二医院普外科,辽宁,沈阳,110004;中国医科大学附属第一医院普外科,辽宁,沈阳,110004【正文语种】中文【中图分类】R735.8【相关文献】1.人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究 [J], 沈加斌;徐攀;李鑫雨;张立;郑海燕;雍彬2.人肝细胞癌相关抗原661基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化 [J], 李树蕾;谭岩;刘力华;段秀梅;方艳秋;许淑芬3.人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定 [J], 宁晓暄;吴开春;李源;时永全;樊代明4.人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测 [J], 侯红军;李淑媛;赵民朝5.突变人GM-CSF基因在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 马莉;白泉;王骊丽;耿信笃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究
人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究应敏刚;林绍峰;谢云青;郑秋红【摘要】目的在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70基因并纯化表达产物.方法以人HSPO cDNA为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物克隆到表达载体pET30a上,将重组质粒pET30a-HSP70转化大肠杆菌B121上,经IPTG诱导后,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot验证并纯化.结果应用PCR方法扩增出约1 900 bp的目的片段;经酶切鉴定和DNA测序证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-30a上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量约为70 kD处有蛋白表达,Westem blot证实其为目的蛋白,纯化后的HSP70纯度达到90%以上.结论在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70蛋白并且经过纯化,为研究HSP70的结构、功能及临床应用提供了必要条件.【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2007(022)003【总页数】4页(P228-230,234)【关键词】热休克蛋白70;基因重组;原核表达;纯化【作者】应敏刚;林绍峰;谢云青;郑秋红【作者单位】350014,福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院;350014,福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院;350014,福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院;350014,福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院【正文语种】中文【中图分类】R73-34热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于生物体内高度保守的蛋白质,其在免疫应答中的作用成为近年研究的热点。
Srivastava[1]首次发现从肿瘤组织提取的HSPs可导致移植瘤排斥反应。
此后，证实HSP70本身无免疫原性,但可以作为抗原肽的载体及佐剂,协助机体识别抗原肽，而真正的免疫原是与之相伴的抗原肽[ 2]。
Blahere等[3]率先发现热休克蛋白与抗原多肽在体外交联，也可以象体内那样诱发特异性免疫反应。
人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究
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热休克蛋白70基因的序列分析
热休克蛋白70基因的序列分析作者：田帅来源：《活力》2013年第16期[摘要]利用对苜蓿夜蛾的热休克蛋白的克隆分析，了解苜蓿夜蛾的热休克蛋白DNA结构。
[关键词]热休克蛋白；特性；序列分析1 热休克蛋白的介绍1.1 热休克蛋白国内外研究现状1.1.1热休克蛋白热休克蛋白又称热应激蛋白，是机体在应激情况下细胞内迅速合成的一组蛋白质，具有高度的保守型以及应激性，普遍存在于从细菌到人的整个生物界中。
当生物细胞在受热、受损、应激刺激（如缺血、缺氧、重金属离子、射线、病毒感染、DNA损伤等）作用下，都会发生热休克反应，抑制一些正常蛋白质的合成、折叠，致使疏水区暴露相互聚集结合形成不溶性沉淀，与此同时细胞启动热休克蛋白基因，合成热休克蛋白，阻止蛋白的相互结合。
小分子量Hsp家族蛋白质降解，类杭原加工.淋巴细胞回巢.自身免疫性。
其中，Hsp70家族是生物体内最保守的和最重要的热休克蛋白家族，它在原核生物和真核生物体内都存在，并存在于所有的细胞区室和器官中。
1.2热休克蛋白701.2.1热休克蛋白70Hsp70家族是分子量在70KDa左右的热休克蛋白，其不仅能在热胁迫下表达，而且也组成性的存在于所有的活体细胞中。
Hsp70家族是Hsp中最保守的一类。
Hsp70家族主要包括结构型Hsc70和诱导型Hsp70两种类型。
当谈及Hsp70时就是指Hsp70和Hsc70。
这两种蛋白质的氨基酸序列有90%是相同的，它们的生化性除了电泳泳动度稍有差异外，其它大部分特性也是相同的。
1.2.2热休克蛋白70的特性：Hsp70家族的成员由于其氨基酸有很高的同源性、蛋白结构上的相似性，所以它们具有一些共同的生物学性质。
Hsp70家族具有弱的ATP酶活性，与肌肉的肌动蛋白结构很相似，当ATP酶活性被激活时可与伸展的多肽结合，并且它具有保护生物体中各种酶免受热损伤，使聚合的蛋白质解聚等生化特点1.2.3热休克蛋白70的功能：在众多种类的Hsp蛋白中，最重要的是Hsp70，而且也是现在研究最多、最深入的。
人热休克蛋白70的原核高效表达
人热休克蛋白70的原核高效表达高娟;杨守京;付勇;刘彦仿【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2004(015)004【摘要】将人热休克蛋白基因hsp70片段克隆到高效原核表达载体pMAL-c2X 中,酶切鉴定并进行DNA测序.将该重组表达载体转化大肠杆菌DH5α,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达.收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Westem blot检测,并以凝胶薄层扫描分析表达水平.结果表明,成功地构建了含人hsp70基因的表达载体pMAL-c2X/hsp70,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为110 000并具有抗原活性的融合蛋白;改变诱导温度和时间,目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同.对人hsp70基因的克隆、表达,并对其进行表达条件的优化,为研究HSP70的结构、功能与临床应用提供了必要条件.【总页数】4页(P338-341)【作者】高娟;杨守京;付勇;刘彦仿【作者单位】第四军医大学,病理学教研室,西安,710032;第四军医大学,病理学教研室,西安,710032;第四军医大学,病理学教研室,西安,710032;第四军医大学,病理学教研室,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786【相关文献】1.人热休克蛋白70的原核表达和纯化的实验研究 [J], 应敏刚;林绍峰;谢云青;郑秋红2.人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达 [J], 唐鹿群;张蕾;郭人花;刘丰;苏川;束永前3.团头鲂（Megalobrama amblycephala）两种热休克蛋白70（HSP70s）的原核表达、纯化及鉴定 [J], 明建华;谢骏;徐跑;戈贤平;刘文斌;叶金云4.凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达 [J], 吴任;谢数涛;孙勇;完颜小青;张其中5.人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达 [J], 党育平;王刚;范雪莉;沈柱;樊建勇;刘玉峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定
人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定宁晓暄;吴开春;李源;时永全;樊代明【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2002(027)011【摘要】为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70(HSP70)的基因,以质粒为模板,采用PCR方法进行扩增,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收大小约1.96kb的片段;回收片段经T-A克隆法克隆到pUCm-T载体上,并进行DNA测序;将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后,亚克隆到表达载体pET-21a(+)上;将重组质粒pET-21a(+)/ HSP转化大肠杆菌,经IPTG诱导后,收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测. 结果表明,应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段,序列测定结果证实,扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致;经EcoR Ⅰ+Xho Ⅰ酶切及PCR鉴定证实,HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a(+)上;转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE,发现在分子量为72 000处有表达量明显增多的蛋白条带,Western blot证实其为目的条带. 表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因.【总页数】3页(P973-975)【作者】宁晓暄;吴开春;李源;时永全;樊代明【作者单位】710032,西安,第四军医大学西京医院;710032,西安,第四军医大学西京医院;710032,西安,第四军医大学西京医院;710032,西安,第四军医大学西京医院;710032,西安,第四军医大学西京医院【正文语种】中文【中图分类】R730.3【相关文献】1.人热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达及鉴定 [J], 马杰;张英;罗琳;孔宁;颜炜群;焦平;宿晓云;贺巾超;杨莉莉;王建秋;耿学军;范伟全;魏传宇2.人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 李航宇;傅庆国;孔凡民;隋春阳;翟振华;孙宏治;刘金钢;郭仁宣3.人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测 [J], 侯红军;李淑媛;赵民朝4.人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定 [J], 马静;王炜;赵文明;李慎涛;曾牧;刘振龙5.抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定 [J], 孙志伟;赵君;王双;俞炜源;刘彦仿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测
抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测黄帆;徐康;吴兴刚;马中富;林正【期刊名称】《中华危重病急救医学》【年(卷),期】2006(018)009【摘要】目的探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72(hHSP72)与组氨酸(His)的融合蛋白并制备其抗体血清的方法.方法将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX-1TM,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得His-hHSP72融合蛋白.采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔,制备抗血清;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测重组抗原的免疫活性.结果重组质粒酶切鉴定结果表明,hHSP72基因已正确插入到pPROEX-1TM中,经IPTG诱导后,表达出分子质量约为73 ku的蛋白,获得了效价为1:100 000的多克隆抗体.Western blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合,其效价高于市售的单克隆抗体.结论用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达,并能制备得到多克隆抗体;这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂.【总页数】4页(P531-534)【作者】黄帆;徐康;吴兴刚;马中富;林正【作者单位】510080,广州,中山大学附属第一医院神经内科;510080,广州,中山大学附属第一医院中心实验室;510080,广州,中山大学附属第一医院中心实验室;510080,广州,中山大学附属第一医院普内科;510080,广州,中山大学附属第一医院中心实验室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.系统性红斑狼疮患者抗热休克蛋白90抗体的检测 [J], 朱里;黄长征;冯爱平;刘厚君;涂亚庭2.褶纹冠蚌（Cristaria plicata）热休克蛋白70的原核表达及多克隆抗体制备 [J], 谢彦海;俞泽溪;文春根;胡宝庆3.牛诱导型热休克蛋白72多克隆抗体的制备 [J], 姜斐斐;田文儒;高善颂;王恺;王小伟4.黄鳝血清转铁蛋白多克隆抗体的制备及检测 [J], 雷华明;李伟5.非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达和多克隆抗体制备 [J], 陈金凤;邬向东;吴琼;唐玉新;丁珍;乐伟;何永;吴丽琴;贾宝玉;邓小淇;胡睿铭;黄冬艳;宋德平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
热休克蛋白免疫增效作用研究进展
热休克蛋白免疫增效作用研究进展吴燕;王琦;周碧君;石平;黄德江;程振涛【摘要】热休克蛋白是生物细胞受到应激原刺激后产生的一类细胞伴侣蛋白，其包括了大分子量 H SP家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、小分子量HSP 家族和泛素等。
其在淋巴细胞和巨噬细胞的活化、抗原经典呈递和交叉呈递途径以及作为佐剂增强抗原的免疫原性，调节机体的免疫应答水平方面发挥了重要作用。
在疫苗研究中，热休克蛋白作为免疫佐剂已被证实具有重要的调节作用。
论文就热休克蛋白的分类、热休克蛋白作为分子伴侣及其在抗原递呈和诱导免疫应答方面的作用研究进展进行综述，为热休克蛋白的进一步研究提供参考。
%Heat shock protein is a class of cellular chaperones produced by living cells after stimulation by the stressor,which include high molecular weightHSPs,HSP90 families,HSP70 families,HSP60 fami-lies,small molecular weight HSPs and ubiquitin,etc.It play an important role in the activation of lym-phocytes and macrophages,antigen presentingvia classic and cross-presentation pathways and as an adju-vant to enhance the immunogenicity of antigens,regulate the body's immune response levels.The function of HSPs as immune adjuvant has been confirmed by many researchs.This article summarized the progress on classification,as a molecular chaperone,the active mechanism of antigen presentation and inducing im-mune responses of heat shock proteins in order to provide a theoretical basis for further study of heat shock proteins.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)008【总页数】4页(P82-85)【关键词】热休克蛋白;免疫增效;作用【作者】吴燕;王琦;周碧君;石平;黄德江;程振涛【作者单位】贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025;高峰镇农业服务中心，贵州贵安 561108;高峰镇农业服务中心，贵州贵安 561108;贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】S852.3热休克蛋白（heat shock protein，HSP）又称应激蛋白或分子伴侣，是一切生物细胞包括原核细胞及真核细胞在受到环境中物理、化学、生物、精神等因素刺激后发生应激反应而产生的一类在生物进化过程中高度保守、由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白［1］。
人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定
人热休克蛋白70基因的克隆、表达及鉴定胡慧中;柏佳宁;张静;何宏轩;段明星【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2007(20)1【摘要】目的克隆人热休克蛋白70(HSP70)基因,构建其原核高效表达载体。
方法将PCR扩增的HSP70基因克隆到原核高效表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌JM109。
挑选阳性克隆,提取质粒pE28b70F,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达目标蛋白。
结果在大肠杆菌中成功表达了HSP70,表达量约占细菌总蛋白的22·3%,其中可溶性目标蛋白占上清总蛋白的12%。
Westernblot表明该目标蛋白具有与鼠抗人HSP70单抗特异结合的抗原活性。
通过Ni2+-NTA亲和柱,从1L诱导产物中纯化出约1520mg重组蛋白,纯度在80%以上。
结论已成功表达HSP70,为进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了基础。
【总页数】4页(P22-24)【关键词】热休克蛋白;基因克隆;原核表达【作者】胡慧中;柏佳宁;张静;何宏轩;段明星【作者单位】清华大学生物科学与技术系生物膜与膜生物工程国家重点实验室;河北师范大学生命科学院;中国科学院动物研究所国家野生动物疫病研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.人热休克蛋白70和热休克固有蛋白70的基因克隆和表达 [J], 周锦勇;潘金顺;周乙华2.重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定 [J], 韩世伟;张阳德;万小平;陈玉祥3.人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定 [J], 马静;王炜;赵文明;李慎涛;曾牧;刘振龙4.太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)热休克蛋白70(HSP70)基因克隆及在金属胁迫下的表达分析 [J], 李彬;景斐;武敏敏;张建设5.人热休克蛋白70D的基因克隆、表达及蛋白纯化 [J], 常卫红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定
细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定【摘要】目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus，Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein，HSP70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。
方法从重组质粒HSP70/pGEM-T中酶切HSP70目的片段，亚克隆入表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达，经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化，SDS-PAGE 和Western blot方法鉴定表达产物。
结果成功构建Eg.HSP70/ pET-28a/ E.coli BL21基因工程菌株，诱导表达重组蛋白和纯化分离得到14kDa Eg.HSP70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。
结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。
【关键词】细粒棘球蚴；热休克蛋白HSP70；表达；纯化；免疫鉴定Abstract: Objective To const ruct HSP70 gene gene and express prokaryotically it , to purify and identify the immunogenicity of recombinant HSP70 protein. Methods Eg.HSP70 gene was attained from Eg.HSP70/pGEM-T recombinant plasmid and subcloned into high level expressed vector pET-28a. E.coli BL21(DE3)plys was sonst ructed. Western blot and ELISA were used to identify the immunogenicity of therecombinant protein. Results E.coli BL21(DE3)plys srecombinant plasmid was const ructed. Western blot analysis showed that recombinant protein and protoscolex , cystic fluid and cystic wall of 14kDa Eg.HSP70 could be recognized by this antibody.Conclusion pET-28a/HSP70 recombinant plasmid is constructed and expressed efficiently. The antigenicity and immunogenicity of Eg.HSP70 protein is identified.Key words: Echinococcus granulosus；heat shock protein70；protein expression；purification；immunological identification细粒棘球蚴病(Echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg.)幼虫引起的一种人畜共患寄生虫病，呈世界性分布。