SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是一种用于分离不同分子量的蛋白质的实验方法。
在PAGE实验中,蛋白质在电场的作用下,会根据其分子量大小在聚丙烯酰胺凝胶中进行迁移。
分子量越大的蛋白质,其迁移率越慢。
PAGE实验结果的分析主要根据以下几个方面:•蛋白质条带的数量:表示样品中存在的蛋白质种类。
•蛋白质条带的大小:表示蛋白质的分子量。
•蛋白质条带的形状:表示蛋白质的完整性。
以下是PAGE实验结果的常见分析方法:•标准品对照:使用已知分子量的蛋白质标准品作为对照,可以用来确定样品中蛋白质的分子量。
•SDS-PAGE:SDS-PAGE是一种常用的PAGE方法,在该方法中,蛋白质会被SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂处理,使其变性并失去其原有的结构。
因此,SDS-PAGE实验结果主要根据蛋白质条带的大小来判断分子量。
•非变性PAGE:非变性PAGE是一种不使用SDS和还原剂的PAGE方法,在该方法中,蛋白质可以保持其原有的结构。
因此,非变性PAGE实验结果主要根据蛋白质条带的形状来判断分子量。
以下是PAGE实验结果的常见示例:•单一蛋白质:如果样品中只有一种蛋白质,那么凝胶中将会出现一个单一的条带。
•多种蛋白质:如果样品中存在多种蛋白质,那么凝胶中将会出现多个条带。
•蛋白质变性:如果蛋白质在样品制备过程中发生变性,那么凝胶中可能会出现多个条带,或者条带的形状会发生变化。
PAGE实验结果可以用于以下目的:•蛋白质纯度分析:通过比较样品中蛋白质条带的数量和大小,可以判断样品的纯度。
•蛋白质分子量测定:通过对比样品中蛋白质条带的大小和标准品条带的大小,可以测定样品中蛋白质的分子量。
•蛋白质鉴定:通过对比样品中蛋白质条带的大小和形状,可以进行蛋白质鉴定。
实验结果实验材料•样品:肌肉组织蛋白•标准品:蛋白质分子量标准品•凝胶:10% SDS-PAGE凝胶•染色剂:溴酚蓝实验步骤1. 将样品和标准品制备成均匀的溶液。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量解析

【实验步骤及操作方法】
1.安装垂直板电泳槽 将密封胶条放在平直玻璃板上,将凹形
玻璃板与 平直玻璃板重叠。 用手将两块玻璃板夹住,放入电泳槽内。 用蒸馏水检漏
2.电泳缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液,pH=8.3):取 Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用去离子水 溶解后定容至1L。
3.样品溶解液(用于溶解标准蛋白质及样品蛋白 质):取SDS0.1g,巯基乙醇0.1mL,甘油 1.0mL,溴酚蓝28.8g,0.2mol/L磷酸缓冲液 0.5mL,加重蒸馏水至10mL。
【试剂配制】
4. 染 色 液 : 0.25g 考 马 斯 亮 蓝 R-250 , 加 入 454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸。
5.脱色液:75mL冰乙酸,875mL水与50mL甲醇 6.10% 过 硫 酸 钠 、 10%SDS 、 1% 四 甲 基 乙 二 胺
(TEMED)
【实验材料及预处理】
蛋白质相对分子质量的测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
【实验目的】
• 理解电泳法测定蛋白质分子量的原理。 • 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本操
作 • 学会绘制标准曲线。
【实验原理】
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和N,N-甲叉双 丙烯酰胺(Bis)聚合而成,是一种具有交叉网状结构的 凝胶,可以产生分子筛效应,其孔径大小可以通过配置 药品的浓度来控制,常用作电泳的载体。
因此,我们可以测定标准蛋白质的迁移率,通过标 准蛋白质相对迁移率的对数对相对分子量作图,得到标 准曲线,根据标准曲线计算出未知蛋白质的相对分子质 量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺(AA):用于制备凝胶,是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺(MBA):交联剂,增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED):催化剂, 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵(APS)
引发剂,产生自由基,引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠,用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展,可以发展新型的蛋白质分离技术, 如二维电泳、毛细管电泳等,以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中,可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合,如质谱技术、免疫学检测等,进行多维度分析,更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷,从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白,可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比,因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具,确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液,并确保其在有效期内。
sdspage实验报告

sdspage实验报告SDS-PAGE实验报告引言:SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
通过SDS(十二烷基硫酸钠)的作用,可以使蛋白质在电泳过程中带有负电荷,从而使其按照分子量大小在凝胶上进行分离。
本实验旨在通过SDS-PAGE技术分离和分析不同来源的蛋白质样品,探究其分子量和纯度。
材料与方法:1. 样品制备:从不同来源(如细菌、植物、动物)获得蛋白质样品,并进行样品的提取和纯化。
2. SDS-PAGE凝胶制备:根据所需分离范围选择合适的凝胶浓度,并制备上胶液和下胶液。
3. 样品处理:将样品与样品缓冲液混合,并加入还原剂和SDS。
4. 电泳条件:将样品加载到凝胶孔中,进行电泳操作。
设置适当的电压和时间。
5. 凝胶染色:将电泳后的凝胶进行染色,以可视化蛋白质带。
结果与讨论:通过SDS-PAGE技术,我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。
在电泳过程中,蛋白质样品在电场作用下向阳极迁移,其迁移速率与其分子量成反比。
因此,我们可以根据蛋白质在凝胶上的迁移距离来推测其分子量。
观察到的凝胶图像显示出多个蛋白质带,每个带代表一个具有特定分子量的蛋白质。
通过与已知分子量标准品进行比较,我们可以推断出样品中蛋白质的分子量范围。
同时,通过比较不同来源的样品,我们可以观察到它们之间的差异。
在某些情况下,我们可能观察到一些额外的带,这可能是由于蛋白质的不同修饰或附加物所致。
例如,糖基化的蛋白质可能会在凝胶上显示出多个带,每个带代表不同程度的糖基化。
此外,我们还可以通过观察蛋白质带的强度来推断其纯度。
如果某个蛋白质带非常明亮且没有其他杂质带的干扰,那么可以认为该蛋白质具有较高的纯度。
相反,如果某个带非常弱或有其他带的干扰,那么可能表示该样品中存在其他蛋白质或杂质。
结论:通过SDS-PAGE技术,我们成功地分离和分析了不同来源的蛋白质样品。
通过观察蛋白质带的位置、分子量范围和强度,我们可以推断蛋白质的分子量和纯度。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

分子生物学实验报告实验名称:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级:生工xxx姓名:xxx同组人:xxx学号:xxxx日期:xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法,为检测电泳后凝胶中的蛋白质,一般使用考马斯亮蓝(CBB)染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好,有弹性,透明,相对地化学稳定,对pH和温度变化比较稳定,在很多溶剂中不溶,是非离子型的,没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度,可以控制孔径在广泛的范围内变动,并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性,因此还适于少量样品的制备,不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵(AP)或过硫酸钾,此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂,最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)。
在叔胺的催化下,由过硫酸铵形成氧的自由基,后者又使单体形成自由基,从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效,所以在低pH时,常会延长聚合时间;分子氧阻止链的延长,妨碍聚合作用;一些金属也能抑制聚合;冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成,以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统,即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统,不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统,其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4%,pH = 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5%,pH = 8.8。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.

sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
实验目的:通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分离蛋白质并测定分子量。
实验原理:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法,可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。
在本实验中,通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中,以使蛋白质带有几乎相同的负电荷,通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动,最终被染色,进行分离鉴定。
实验步骤:
1.准备实验材料:SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。
2.制备SDS-PAGE电泳凝胶:按照说明书,将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间,使其柔软。
3.制备电泳缓冲液:按照说明书,取适量的Tris、glycine和SDS等物质,配制电泳缓冲液,使其达到所需浓度。
4.制备试样缓冲液:按照说明书,取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质,配制试样缓冲液。
5.制备样品:取适量的蛋白质样品,在试样缓冲液中煮沸一段时间,使蛋白质分子展开。
6.装样:将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。
7.电泳:按照说明书,调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件,开启电泳装置,进行电泳操作。
8.染色:将电泳板取出,进行荧光染色或银染色法。
9.图像处理:使用图像分析系统或其他软件,进行蛋白质条带的分析和图像处理。
实验结果:经过SDS-PAGE电泳后,样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带,通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。
根据蛋白质的分子量大小,可以判断样品中含有哪些蛋白质。
实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和形状。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)和还原剂(如巯基乙醇)处理蛋白质样品, 则蛋白质分子中的二硫键被还原, 1g蛋白质可定量结合1.4g SDS。
由于SDS呈解离状态, 使蛋白质亚基带上大量的负电荷, 其数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
各种蛋白质-SDS复合物表现出相等的电荷密度, 在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时, 它们纯粹按照分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离, 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性关系。
用这种方法测定蛋白质的Mr, 简便、快速, 只需要廉价的设备和μg量的蛋白质样品。
所得的结果, 在Mr为15000~200000的范围内, 与用其他方法测得的Mr相比, 误差一般在±10%以内。
因此SDS测定Mr的方法, 已得到非常广泛的应用和迅速的发展。
现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。
实验证明, 在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后, 巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键;SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。
在一定的条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。
由于十二烷基硫酸根带负电, 使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷, 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量, 因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。
1.在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时, 应注意以下几个问题:如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4gSDS/1g蛋白质的比率并具有相同的构象, 就不能得到准确的结果。
影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个: ⑴二硫键是否完全被还原: 只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下, SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去, 并使之具有相同的构象。
“SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白”生化实验报告

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白操作人:XXX 时间:XXXX 地点:XXXX温度:25℃一、实验目的:1.了解SDS聚丙烯酰胺凝胶分离检测蛋白的原理;2.掌握制作SDS聚丙烯酰胺凝胶的方法;3.掌握电泳槽的正确摆放方法;4.掌握完成电泳后染色和洗脱额方法。
二、试验方法与过程:1 制作聚丙烯酰胺凝胶:1.1 安装玻璃板:搭配长短玻璃板,将玻璃板正确固定在架子上。
1.2 检查密封性:用移液枪将蒸馏水注入两块玻璃板之间,若页面没有下降,说明密封性良好,倒掉蒸馏水,用吸水纸吸干水分,进入下一步。
2 配胶2.1 配分离胶(12%):按顺序将下列溶液加入烧杯,搅拌均匀,迅速用移液器转移至玻璃板之间,加至约2/3的高度,在其上加蒸馏水使其上侧水平,室温放置约20min,将上层的水倒去,用滤纸吸干水分。
2.2 配浓缩胶(5%):按顺序将下列溶液加入烧杯,搅拌均匀,迅速用移液器转移至玻璃板之间,加至接近玻璃板上端,插入样梳,室温放置约20min,拔掉样梳3 样品的制备取40 μL样品,加入10 μL loading Buffer,金属浴煮沸10min。
12000rpm离心3min4 上样及电泳分别取20μL诱导前样品、诱导后样品、纯化后样品,8μLmarker上样,200V电泳30min。
5 染色、洗脱、观察将聚丙烯酰胺凝胶从玻璃板上取下,用蒸馏水冲洗数次后置于摇床上染色10min,倒掉染液,倒入洗脱液,置于摇床上,每隔10min更换洗脱液,直至条带清晰为止。
三、原始数据:从左至右分别为诱导前样品、诱导后样品、marker、纯化后样品、纯化后样品。
上样在上部四、结果处理与分析:电泳结果较好:电泳显示的条带还是较清晰。
经分析,诱导前的样品含有多种蛋白质,因此跑出的条带多且密集。
诱导后的样品可明显观察到也含有多种蛋白质,但有一条明显颜色深度及宽度大于其他条带。
结合marker条带分析,纯化后的蛋白的分子量位于35.0kDa至45.0kDa之间,约为38.0kDa;诱导后的样品为分子量约为38.0kDa、42.0kDa的蛋白被诱导表达。
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分子生物学实验报告实验名称:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级:生工xxx姓名:xxx同组人:xxx学号:xxxx日期:xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法,为检测电泳后凝胶中的蛋白质,一般使用考马斯亮蓝(CBB)染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法.1 实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好,有弹性,透明,相对地化学稳定,对pH和温度变化比较稳定,在很多溶剂中不溶,是非离子型的,没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度,可以控制孔径在广泛的范围内变动,并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性,因此还适于少量样品的制备,不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵(AP)或过硫酸钾,此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂,最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)。
在叔胺的催化下,由过硫酸铵形成氧的自由基,后者又使单体形成自由基,从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效,所以在低pH 时,常会延长聚合时间;分子氧阻止链的延长,妨碍聚合作用;一些金属也能抑制聚合;冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成,以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统,即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统,不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统,其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4%,pH = 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5%,pH = 8.8。
电极缓冲液的pH = 8.3,用Tris、SDS和甘氨酸配制。
配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。
这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子,Cl-、甘氨酸阴离子以及蛋白质-SDS复合物,在浓缩胶的pH值下,甘氨酸只有少量的电离,所以其电泳迁移率最小,而Cl-的电泳迁移率最大。
在电场的作用下,Cl-最初的迁移速度最快,这样在Cl-后面形成低离子浓度区域,即低电导区,而低电导区会产生较高的电场强度,因此Cl-后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。
达到稳定状态后,Cl -和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。
而蛋白质-SDS复合物由于相对量较少,聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被浓缩成很窄的区带(可以被浓缩三百倍),所以在浓缩胶中Cl-是快离子(前导离子),甘氨酸是慢离子(尾随离子)。
当甘氨酸到达分离胶后,由于分离胶的pH值(通常pH = 8.8)较大,甘氨酸离解度加大,电泳迁移速度变大超过蛋白质-SDS复合物,甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质-SDS复合物。
这时蛋白质-SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳,向正极移动。
由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置。
当指示剂到达凝胶底部时,停止电泳,从平板中取出凝胶。
在适当的染色液中(如通常使用的考马斯亮蓝)染色几个小时,而后过夜脱色。
脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料,这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。
通常凝胶制备需要1~1.5小时,电泳在25~30mA 下通常需要3小时,染色2~3小时,过夜脱色。
通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳[2]。
2.1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。
当分析一个未知样品时,常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测,而后选出适宜的凝胶浓度。
凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要,胶太软易断裂,;太硬则脆,也易折断。
2.1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。
如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇,则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。
在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原;SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成蛋白质-SDS复合物。
SDS与蛋白质的结合带来两个后果:第一,使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别,使所有的SDS-蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷/蛋白质比向正极移动;第二,SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。
这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是蛋白质分子量的函数。
选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物,使其形成SDS复合物。
把这些复合物在相同条件下进行电泳分离,分子量小的物质泳动距离大,分子量大的物质泳动距离小。
测定出相对泳动率,用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图,它们在一定范围内呈直线关系。
因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。
2.1.3染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸,各有优缺点,本实验选用考马斯亮蓝R250,它的染色灵敏度比氨基黑高5倍,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。
2.2 实验材料2.2.1 试剂所用试剂有10%SDS、30%凝胶贮液(29%ACr-1%Bis)、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液、上样缓冲液、蛋白质Maker、0.25%考马斯亮兰R250染色液、甲醇:醋酸脱色液、异丙醇、tris-HCl(PH6.8)缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水等。
2.2.2 器材所用器材有垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、50ml小烧杯、移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套等。
.2 实验方法.2.1 SDS聚丙烯酰胺的灌制按说明安装玻璃板,橡胶条放在两玻璃板之间,确定不漏液,玻璃板放入电泳槽时,有凹槽的一侧向里,时刻保持玻璃片间的压力。
根据表1制备分离胶溶液,加入TEMED后迅速旋转混合物,用1ml 移液枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中(灌制红色板的上边缘)。
用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。
将凝胶垂直放于室温下。
(丙烯酰胺有神经毒性,故操作时应注意不要吸入其粉末,实验时应戴手套,剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔,待聚合后再处理)待聚合后(40min),倒掉覆盖层,用去离子水清洗凝胶顶部,尽可能倒掉凝胶上的液体,用滤纸吸干水分。
按表1配置浓缩胶,加完TEMED后迅速旋转混合,注满玻璃板间隙,插入梳子(写有1.5mm的一侧向里,先插入一侧,在从一侧向另一侧压着插入,以排除气泡)将胶垂直放置于室温下。
约30min聚合完成,拔出梳子(平行拔出),用去离子水冲洗胶孔,再用滤纸吸干水。
取出玻璃板,取下橡胶条。
表1分离胶与浓缩胶配制组分10%分离胶(ml)5%浓缩胶(ml)H20 4.0 2.730%丙烯酰胺 3.30.671.5mol/LTris(PH8.8)2.5-1mol/LTris(PH6.8)-0.510%SDS0.10.0410%APS0.10.04TEMED(最后加)5μl3μl总体积104.2.2 电泳样品处理:将未加IPTG诱导的菌液37摄氏度摇至OD600=0.6-0.8左右,离心部分菌液分装,分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液,其余菌液加至0.5mM 浓度的IPTG 20摄氏度进行诱导10h,分装菌液离心后分别加入适量不含DTT与含DTT的上样缓冲液。
电泳槽中加入300ml电泳缓冲液,所有样品均需煮沸10min,然后用20μl加样枪依次加入IPTG诱导前的蛋白样品(20ul)、诱导前加DTT的(20ul)、诱导后样品(20ul)和诱导后加DTT的(20ul)、蛋白Maker,其余空加入等量的上样缓冲液。
盖好盖子连接电源(红接红,黑接黑),慢慢调节电压至90V,进行电泳,待指示剂达到分离胶,把电压加到150V,至指示剂的红色条带移除胶体,停止电泳。
.2.3 染色、脱色将胶取出,并在右上角切个角,以标记顺序,放入培养皿中加入约40ml染色剂,放在摇床上染色1h,倒掉染色剂,先用清水洗几次,倒掉清水,再把胶放入脱色液中,脱色一天,每隔3h换一次脱色液,最后把胶取出来沥干水,拍照。
3 结果凝胶经脱色后观察结果,拍照得到的电泳条带如图2所示。
其中5、6、7、8条带为本组样品条带,所对应的样品分别为:IPTG诱导前的蛋白质样品、诱导前加DTT的蛋白质样品、诱导后的蛋白质样品和诱导后加DTT的蛋白质样品。
最左端的电泳条带所对应的样品为蛋白质Maker,条带9所对应的样品为缓冲液。
图1为蛋白质Marker的电泳条带图示。
图1蛋白质Maker电泳条带图示图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Maker 1 23 4 5 67 8 94 讨论4.1 对实验结果的分析及结论7、8条带和5、6条带相比,7、8条带的颜色更深。
说明IPTG对蛋白质有诱导作用,能使蛋白质的构象发生变化,从而更易被染色。
6、8条带和5、7条带相比,6、8条带中最上方的那条带颜色很浅,几乎没有。
因为DTT可以将蛋白质中二硫键的还原,用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
从而将大的蛋白质分子打断为若干小的蛋白质分子。
所以最上方的条带颜色很浅,也间接证明了这条带中的蛋白质富含半胱氨酸等能形成二硫键的氨基酸。
对比蛋白质Maker电泳条带图示,从蛋白质电泳条带的整体来看,样品中大部分蛋白质的分子量在18.4-116kDa之间。
本次实验的电泳条带比较清晰,各条带对比明显,比较成功。
4.2 影响电泳分离的主要因素[2]4.2.1 待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。