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《酶工程》课件-动植物细胞培养产酶
（6）动物细胞、植物细胞和微生物细胞用于生产的主要产物 各不相同。
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
8
一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
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一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
动植物细胞培养产酶 (3)优秀课件
动植物细胞培养产酶 (3)优 秀课件
第三章 动植物细胞培养产酶
主要内容 植物细胞培养产酶 动物细胞培养产酶
要求 了解动、植物细胞及其培养的特点； 熟悉动、植物细胞培养的工艺条件及其控
制。
一、概述
1.什么是动、植物细胞Байду номын сангаас养？
动植物细胞在体外条件下的存活或生长。
2.如何获得动、植物细胞？
（3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；
（4适）宜植温物度细在胞20一℃般-2以5℃蔗，糖酶为合碳成源温、度浓因度植为物2-种5%类。而异；
通气和搅拌 植物细胞培养要求稳定的pH，一般控制在pH5.8-6.1最好。
耗氧速率较慢，细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感，所以，通气
其他和搅拌不能太强烈。
光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。
外45植） ）体提其高他的产选品择质和量处理→愈伤组织的诱导→ 细胞对的剪获切取力敏→感细、胞生培产周养期→长分、离生纯长和化→产物
代谢需要一定的光照。 外植体的选择与处理：
选择外植体、切取片机段械、捣消碎毒发处：理动。作轻柔
直接分离法
植物愈伤组织
过滤、离心分离
愈伤组织诱导法
酶分解法：纤维素酶、果胶酶等
原生质体能再迅生速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团
外植体
插入 半固体培养基
培养
去除细胞壁后得到的微球体 灭菌、冷却
25℃
生长素、分裂素
1-3周
愈伤组织
分散、接种
3、植物细胞培养产酶的工艺特点
培养基
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；
培养温度和pH （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；
第三章 动植物细胞培养产酶
主要内容 植物细胞培养产酶 动物细胞培养产酶
要求 了解动、植物细胞及其培养的特点； 熟悉动、植物细胞培养的工艺条件及其控
制。
一、概述
1.什么是动、植物细胞Байду номын сангаас养？
动植物细胞在体外条件下的存活或生长。
2.如何获得动、植物细胞？
（3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；
（4适）宜植温物度细在胞20一℃般-2以5℃蔗，糖酶为合碳成源温、度浓因度植为物2-种5%类。而异；
通气和搅拌 植物细胞培养要求稳定的pH，一般控制在pH5.8-6.1最好。
耗氧速率较慢，细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感，所以，通气
其他和搅拌不能太强烈。
光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。
外45植） ）体提其高他的产选品择质和量处理→愈伤组织的诱导→ 细胞对的剪获切取力敏→感细、胞生培产周养期→长分、离生纯长和化→产物
代谢需要一定的光照。 外植体的选择与处理：
选择外植体、切取片机段械、捣消碎毒发处：理动。作轻柔
直接分离法
植物愈伤组织
过滤、离心分离
愈伤组织诱导法
酶分解法：纤维素酶、果胶酶等
原生质体能再迅生速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团
外植体
插入 半固体培养基
培养
去除细胞壁后得到的微球体 灭菌、冷却
25℃
生长素、分裂素
1-3周
愈伤组织
分散、接种
3、植物细胞培养产酶的工艺特点
培养基
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；
培养温度和pH （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；
动植物细胞培养产酶
合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入
平衡期而停止酶的生物合成； 不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长 而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞 生长一段时间甚至在平衡期后， 酶才开始合成并大量积累。
第三节 酶生物合成的模式
理想的酶合成模式
发酵产酶， 为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合 成模式应是延续合成型：在发酵过程中没有生长期和产酶期的 明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平 衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。 对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先 进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化控制, 使他 们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
and
Monod的工作：
第三节 酶生物合成调节
第三节 酶生物合成调节
3、分解代谢物阻遏：
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直 接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程 中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
第三节 酶生物合成的模式
细胞在一定条件下培养生长， 其生长过程一般经历调整 期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 。 把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续 合成型，中期合成型和滞后合成型。
。 机与速度。
4.结构基因：决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关 系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
第三节 酶生物合成调节
2、原核生物酶合成调节的操纵子类型： （1）诱导 Induction 组成酶(constitutive enzymes)：细胞固有的酶类。 诱导酶(inducible enzymes：细胞为适应外来底物或其结构类似 物临时合成的一类酶。 。
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
酶工程第三章 细胞工程产酶
（3）White培养基 为番茄根尖培养而设计的培养基。 该培养基成分比较简单，无机盐和糖 的浓度较低。 适用于生根培养。
（4）KM-8P培养基 为原生质体培养而设计的培养基。 其特点是有机成分的种类较全面，包 括多种单糖、维生素和有机酸。 在原生质体培养中广泛应用。
3.植物细胞培养基的配制 （一）母液的配制 对于经常使用的培养基，为了减少每 次配制培养基时称取试剂的麻烦，同时为 了减少微量试剂在称量时造成的误差，可 先将各种药品配制成10倍或100倍浓度的母 液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。
在这些物质的合成中的任何环节发生 障碍，有可能引起生长停止，甚至导致机 体发生突变或死亡。
次级代谢是某些微生物为了避免代谢 过程中，某种代谢产物的积累造成的不利 作用，而产生的一类有利于生存的代谢类 型，通常是在生长后期合成。 通过次级代谢合成的产物称为次级代 谢产物。 这些代谢产物并不是微生物生长所必 需的，即使在这些代谢的某个环节上发生 障碍，也不会导致机体生长停止或死亡， 仅仅是影响了机体合成次级代谢产物的能 力。通常它们以多组分的形式存在。
植物细胞可以 直接从外植体中 分离得到。
（2）愈伤组织诱导法 愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定 结构和功能的薄壁细胞团。 通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的 基本过程如下： 将选择好含有一定量的生长素和分裂 素的液体培养基加入0.7％～0.8％的琼脂， 制成半固体的愈伤组织诱导培养基。
母液分大量元素、微量元素、铁盐、 有机物、生长调节物质（植物激素）。 配制各种母液时，药品称量要十分精 确。
配制母液一般用蒸馏水或无离子水， 使水中不含或少含某些矿质离子。 （1）大量元素母液：以原用量的10倍配制 （10～50倍），依次溶解，混合定容 1000ml。 （2）微量元素母液：一般配制100倍，定 容1000ml，称量时最好用万分之一的电子 天平。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。