植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养是一种将植物细胞通过人工的方式在无菌条件下进行培养的方法。
它可以用来研究植物生长发育、植物组织和器官的形成、植物代谢产物的生产等。
植物细胞培养的步骤大致分为以下几个步骤：
1. 材料准备：准备需要培养的植物材料，如幼芽、种子、叶片等。
同时准备好无菌培养基、培养器皿和器械。
2. 表皮消毒：将植物材料表皮的细菌和真菌等杂质进行消毒处理，常用的方法有浸泡在含有消毒剂的溶液中，如酒精和次氯酸钠。
3. 组织分离：将消毒后的植物材料进行分离，常用的方法有切碎组织、分离细胞等。
4. 培养基制备：制备无菌的培养基，可以根据具体需求调整培养基的成分，常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
5. 培养：将组织或细胞转移到无菌培养基上进行培养。
可以选择不同的培养条件，如光照条件、温度、激素的添加等。
6. 培养过程中的观察和记录：观察培养物的生长情况，记录细胞的增殖、分化和器官的形成等变化。
植物细胞培养可以应用于植物繁殖、基因转化、抗病性筛选、药物生产等方面。
同时，植物细胞培养也属于一种生物技术手段，可用于保护濒危物种、加速育种进程等。
植物细胞培养
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
植物细胞培养
班级：农学11-2
姓名：徐东阳
概念及发展
植物细胞培养的概念及发展 植物细胞培养的概念
植物细胞培养是指对有力的植物细胞或细胞小聚体 进行立体无菌培养，通过继续代培养使 细胞增殖， 从而获得大量细胞群体的一种技术。
方法
应用
植物细胞培养的发展
1.全能性 （植物学家Hanberlandt根据细胞理论预言。英国人Steward 和法国人Reinert，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中产生了完整的植株， 对植物细胞的全能性给予了科学的证实．） 2.胚培养（E．hanning培养了萝卜的近成熟胚并发育成熟） 3.无毒植 株 （Morel和Martin通过茎尖分生组织培养获得大丽花的无毒植株。） 4.培养基 （B族维生素、生长素IAA、激动素、MS） 5.应用(从科学研究转入生产应用)
植物细胞悬浮培养
游离单细胞方法 培养基 悬浮细胞培养方法 生长测定 同步化处理
培养基
基本培养基：MS、B5、NT、TR、VR、SS、SCN、SLCC等
碳源：蔗糖、葡萄糖、果调节物质：NAA、IAA、2，4-D、6-BA等
悬浮培养方法
分批培养： 分批培养设计 分批培养细胞的增殖 连续培养： 封闭式连续培养 开放式连续培养（化学恒定、浊度恒定）
植物细胞培养的方法 植物细胞培养的概念及发展
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
植物细胞培养的方法
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
茎段优于叶片 帯叶优于不带叶 不同培养基 MS 幼叶 BS幼茎 氮源 硝酸跟含量高促进 铵根含量高抑制 前体饲养 添加抑制剂 添加诱导子 植物生长调节因子 生物反应器 其他（温度、光超声处理，气体组成）
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物细胞培养
悬浮细胞的生长动态
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 细胞同步化： 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 • 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态，因此， 同程度的分化状态，因此，要达到完全同 步化是十分困难的。 步化是十分困难的。 • 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 代谢以及生理生化状态等复杂化。 代谢以及生理生化状态等复杂化。 • 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化。 细胞达到相对同步化。
悬浮培养（Suspension culture） ）
• 悬浮培养 是细胞培养的基本方法，是将单 是细胞培养的基本方法，
个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行 培养增殖的技术。 培养增殖的技术。 • 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。
低温处理
• 可以提高培养体系中细胞同步化的程度 – Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细 等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细 胞较好地同步化。 胞较好地同步化。 – 梅兴国等（2001）采用 ℃低温处理红豆 梅兴国等（ ）采用6℃ 杉细胞也获得较明显同步化效果。 杉细胞也获得较明显同步化效果。 • 可能的原因 – 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的 影响，在一定范围内， 影响，在一定范围内，温度下降使细胞分 裂速度减慢，细胞周期延长， 裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地 延长了分裂期的时间，使分裂指数提高， 延长了分裂期的时间，使分裂指数提高， 细胞同步化率升高。 细胞同步化率升高。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
植物细胞培养
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充 分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。 细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类
封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。
开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
二、培养类型和方法
（一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养， 当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细 胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生 化研究常用的培养方法。
1、成批培养法
（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的 养分为细胞耗尽为止。 （2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在 培养基中的均匀分布。 （3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈 现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。 （4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外 进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养 瓶里，继续进行培养。
细 胞 数 目 静止期 缓慢期
直线生长期
对数增长期
延滞期
时间
细胞生长周期
（二）半连续培养
指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液， 并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复 地取得大量、均一的培养细胞，供生物研 究之用。
（三）连续培养
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并 注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分 补充，保持其恒定体积的培养。
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生 长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培 养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间 延长，细胞密度不断增加。
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植物细胞培养
一、定义
●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振
荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。
●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然
产物的主要来源。
●植物细胞培养具有以下优点：
1、提高产率
2、缩短周期
3、提高产品质量
4、易于管理，减轻劳动强度
因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。
二、培养基
常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基
三、单细胞培养
1、制备方法
（1）机械法（机械磨碎、切割）
（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）
（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）
2、培养方法
（1）平板法（似微生物平板培养）
（2）看护培养与饲养层培养法
看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。
饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。
（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。
①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。
②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。
3、保存
（1）继代培养（高等植物、海藻等）
（2）低温（ 5℃～10℃）
（3）冷冻（ -20℃或液氮）
植物细胞冷冻保存方法：
在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。
植物细胞冷冻保护剂组成：
7.5%二甲基亚砜（DMSO）＋0.5mol／L山梨醇＋5%甘油＋5%蔗糖
四、植物细胞培养的应用
1、生产药用植物代谢产物（紫杉醇、苷类等）
2、生产天然食品、食品添加剂（可可碱等）
3、生产杀虫剂、杀菌剂（鱼藤酮、除虫菊脂）
4、生产饲料、精细化工产品（桑叶、橡胶等）
五、植物细胞的生物反应器大规模培养
1、培养特性
（1）细胞本身特性（生长慢、易结团、易损伤、易污染）
（2）培养液流变特性（黏度增高）
（3）气体传递与影响（O2与CO2需平衡）
（4）泡沫与器壁表面黏附性（气泡增多、黏度大、易黏附，可用硅油、脂肪酸酰胺等消除）
（5）悬浮细胞生长与增殖（静止期前继代）
2、培养过程
（1）细胞的驯化、筛选与细胞株的建立
愈伤组织诱导与培养→单细胞分离→细胞无性系分离→细胞株筛选
（2）扩大培养
采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器培养的种子细胞。
（3）生物反应器培养
3、植物细胞大规模生物反应器培养
搅拌式、鼓泡式、气升循环式
4、植物细胞的生物反应器高密度培养
例：培养紫草细胞、水母雪莲细胞
5、植物细胞生物反应器培养存在的主要问题
生长缓慢；次级代谢物含量低；培养细胞不稳定等；多数产物积累于胞内；不耐受剪切力。
必须首先解决的重要问题：细胞生长及代谢途径基础研究、反应器结构与工艺优化
六、植物细胞两相培养技术
两相培养技术——在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移到有机相中的技术。
其优点是：不仅减少了产物的反馈抑制作用，提高产物含量，而且通过有机相的回收循环使用实现了连续培养。
这种技术最初是应用于蛋白质提取、乙醇发酵及微生物培养上的。
两相培养系统满足条件：
1、添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒，不会影响细胞生长。
2、产物能比较容易被有机物吸附或溶解于有机相中。
3、两相容易分离
4、有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。
七、植物细胞的生物反应器固定化培养
细胞固定化——将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。
常用的固定化方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法等。
常采用包埋法，可以采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻胶、白明胶等作为包埋剂。
八、植物细胞培养存在的问题与发展趋势
1、存在问题
（1）技术问题
生物反应器设计缺陷多
细胞易聚集分层、易变异
放大培养不足
（2）经济方面
成本高、工业化经济效益低
2、发展趋势
（1）高效细胞系的筛选
（2）发展大规模细胞培养所用的培养基，降低成本
（3）开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统
（4）两相培养、固定化培养技术是极具发展前景的技术
（5）对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系进行基础研究。