植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养是一种将植物细胞通过人工的方式在无菌条件下进行培养的方法。
它可以用来研究植物生长发育、植物组织和器官的形成、植物代谢产物的生产等。
植物细胞培养的步骤大致分为以下几个步骤：
1. 材料准备：准备需要培养的植物材料，如幼芽、种子、叶片等。
同时准备好无菌培养基、培养器皿和器械。
2. 表皮消毒：将植物材料表皮的细菌和真菌等杂质进行消毒处理，常用的方法有浸泡在含有消毒剂的溶液中，如酒精和次氯酸钠。
3. 组织分离：将消毒后的植物材料进行分离，常用的方法有切碎组织、分离细胞等。
4. 培养基制备：制备无菌的培养基，可以根据具体需求调整培养基的成分，常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
5. 培养：将组织或细胞转移到无菌培养基上进行培养。
可以选择不同的培养条件，如光照条件、温度、激素的添加等。
6. 培养过程中的观察和记录：观察培养物的生长情况，记录细胞的增殖、分化和器官的形成等变化。
植物细胞培养可以应用于植物繁殖、基因转化、抗病性筛选、药物生产等方面。
同时，植物细胞培养也属于一种生物技术手段，可用于保护濒危物种、加速育种进程等。
植物细胞培养
班级：农学11-2
姓名：徐东阳
概念及发展
植物细胞培养的概念及发展 植物细胞培养的概念
植物细胞培养是指对有力的植物细胞或细胞小聚体 进行立体无菌培养，通过继续代培养使 细胞增殖， 从而获得大量细胞群体的一种技术。
方法
应用
植物细胞培养的发展
1.全能性 （植物学家Hanberlandt根据细胞理论预言。英国人Steward 和法国人Reinert，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中产生了完整的植株， 对植物细胞的全能性给予了科学的证实．） 2.胚培养（E．hanning培养了萝卜的近成熟胚并发育成熟） 3.无毒植 株 （Morel和Martin通过茎尖分生组织培养获得大丽花的无毒植株。） 4.培养基 （B族维生素、生长素IAA、激动素、MS） 5.应用(从科学研究转入生产应用)
植物细胞悬浮培养
游离单细胞方法 培养基 悬浮细胞培养方法 生长测定 同步化处理
培养基
基本培养基：MS、B5、NT、TR、VR、SS、SCN、SLCC等
碳源：蔗糖、葡萄糖、果调节物质：NAA、IAA、2，4-D、6-BA等
悬浮培养方法
分批培养： 分批培养设计 分批培养细胞的增殖 连续培养： 封闭式连续培养 开放式连续培养（化学恒定、浊度恒定）
植物细胞培养的方法 植物细胞培养的概念及发展
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
植物细胞培养的方法
植细胞培养按照不同的分类方法可分为以下几种 按对象： 单倍体培养 原生质体培养 按培养基： 固体培养 液体培养 按培养方式： 悬浮培养 固定化培养
茎段优于叶片 帯叶优于不带叶 不同培养基 MS 幼叶 BS幼茎 氮源 硝酸跟含量高促进 铵根含量高抑制 前体饲养 添加抑制剂 添加诱导子 植物生长调节因子 生物反应器 其他（温度、光超声处理，气体组成）
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物细胞培养
悬浮细胞的生长动态
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 细胞同步化： 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 • 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态，因此， 同程度的分化状态，因此，要达到完全同 步化是十分困难的。 步化是十分困难的。 • 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 代谢以及生理生化状态等复杂化。 代谢以及生理生化状态等复杂化。 • 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化。 细胞达到相对同步化。
悬浮培养（Suspension culture） ）
• 悬浮培养 是细胞培养的基本方法，是将单 是细胞培养的基本方法，
个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行 培养增殖的技术。 培养增殖的技术。 • 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。
低温处理
• 可以提高培养体系中细胞同步化的程度 – Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细 等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细 胞较好地同步化。 胞较好地同步化。 – 梅兴国等（2001）采用 ℃低温处理红豆 梅兴国等（ ）采用6℃ 杉细胞也获得较明显同步化效果。 杉细胞也获得较明显同步化效果。 • 可能的原因 – 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的 影响，在一定范围内， 影响，在一定范围内，温度下降使细胞分 裂速度减慢，细胞周期延长， 裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地 延长了分裂期的时间，使分裂指数提高， 延长了分裂期的时间，使分裂指数提高， 细胞同步化率升高。 细胞同步化率升高。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
第六章 植物细胞培养
平板培养为分离、筛选单细胞无 性系提供了一个有效方法
第五节 植物细胞大规模培养 生产次生代谢物质
Production of Secondary Metabolites by Large-scale Culture of Plant Cells
一、 植物次生代谢和次生代谢产物
（一）次生代谢和次生代谢产物 初生代谢：为维持植物正常的生长发育所 必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、 蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代 谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢 过程中形成的各种产物称为初生代谢产 物。初生代谢产物不稳定，在体内容易 发生转化。
植物细胞全能性的证明
2. 筛选变异体：在生产中，人们总是希望 获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗 虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。通常 的方法是在大量的植株中进行选择。这 种方法不仅工作量大，而且效率低。细 胞培养技术为突变体的筛选提供了快速 有效的方法。在一个培养皿中，一次可 以筛选20万个细胞。 将具有抗性的细胞 挑选出来以后，进行培养、再生，即可 获得抗性植株。
匀桨
过滤
培养
外植体
振荡
液体培养 愈伤组织
振荡
培养上清液
继代培养
液体培养
愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、 分裂能力强的细胞。它是植物受到创伤后或 在植物激素的诱导下形成的。
分化(differentiation)——形态、结构和功 能相同的细胞变成形态、结构和功能互 不同的细胞的过程，如分生组织细胞转 变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。 脱分化(dedifferentiation)——已分化、成 熟的细胞（一般不再分裂）重新恢复分 裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的 过程就是脱分化的过程。 再分化 (redifferentiation)——愈伤组织形 成其它组织或器官的过程
植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
parafilm封口膜将培养皿封严以防污染 在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见 的愈伤组织。
植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种 单细胞中所占的比例来表示。 植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细 胞数)×100％ 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方 法有两种：一是直接计数法，注意计量时要掌 握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚 未长合到一起的时候。二是感光法，在暗室的 红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其 上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲 洗照片计数。
2、看护培养 概念：用一块愈伤组织或植物离体组织 看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞 培养方法
3、微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培 养在小室中的少量培养基上，使其分裂 增殖形成细胞团的方法，称微室培养。
特点： （1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖 形成细胞团的全过程 （2）培养基少，营养和水分难以保持， pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分 裂。
1-2、 酶解法： Takebe等（1968）最
早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉 细胞
加果胶酶
过滤、离心
2、由培养组织分离单细胞
茎段
步骤： (1) 诱导产生愈伤组织； (2) 愈伤组织反复继代， 使组织不断增殖，提 高愈伤组织的松散性；
15ml medium/1g
继代
(3)将愈伤组织 在液体培养基 中培养，建立 悬浮培养物
机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性 在微生物发酵罐的基础上作如下改进： 搅拌装 置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式 因为植 物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养， 因此必须设计加液装置； 由于植物细胞的生理 活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害 气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观 察，一般还设计有取样口。
机械搅拌式培养系统
气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作
用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往 往是容易使培养物污染的部位，因此， 发展出空气提升式生物反应器，但其缺 点是搅拌不均匀
旋转式培养系统： 一般用于产品中 试或某些必需裂 解细胞才能获得 目的产物的培养， 其优点是控制精 确，处理灵活， 缺点是培养体积 较小。
行一些调节。
2、培养细胞的起始密度及细胞记数
（1）最低有效密度的概念 在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细
胞能够增殖的最少接种量称为最低有效 密度或者临界的起始密度。
最低有效密度由于培养材料、原种 培养条件，原种保存时间长短、培养基 的成分不同而有差异，一般为104~105细 胞/ml
2）细胞记数 要保证细胞培养的最低有效密度，在细 胞游离后要对分离的单细胞进行记数， 可用血球记数板
第二部分 细胞培养
定义 ：植物细胞培养（plant cell culture）
是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团 进行培养使其增殖的技术 根据培养规模:小规模培养和大批量培养； 根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等； 根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生 产物的细胞培养。
§1.单细胞分离 §2.悬浮培养 §3.单细胞培养技术
操作注意事项： 对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径 要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-
4细胞），使用吸管或注射器。 继代前，培养容器静置短时间，大细胞
团沉降，再吸上层悬浮液。 依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培
养物。
4、细胞生长的测定
对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态 的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其
§3.单细胞培养技术
一、植物单细胞培养的意义 1、建立单细胞无性系 悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化 上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、 抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、 高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经 济效益。 2、排除体细胞的干扰 3、利于对细胞活动跟踪观察
讨论:
A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培 养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
B、加入条件培养基可以缩短滞后期。 条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的
培养基。 C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养
的细胞一直保持对数生长期。 D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间
太长，则会引起细胞的大量死亡和解体
细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm 一400Pm的团块，悬浮培养较难；
培养时需供氧，培养液粘度大；
具有群体效应；
因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量 较低；
细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化, 从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；
悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长 （25000~50000个/ML）。
E、有丝分裂指数 在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细 胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，
指数越高，分裂进行的速度越快。 一般用孚尔根染色法，先将组织用 1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检，
统计500个细胞，计算。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在 30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全 由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组 织。
§2.细胞悬浮培养(cell suspension culture)
一、细胞悬浮培养的概念和意义 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养
基中进行培养增殖的技术。
Bioreactor for cceollntinuous suspensions
Shaker for suspension culture
二、单细胞培养的方法
1、细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的 细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基 上进行培养，称之为平板培养 主要技术要点： 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团 不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要 选择合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基 洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml
5、植物细胞培养需要解决的问题
（1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均 不利于生长； （2）营养物的供应； （3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化 （4）培养过程中细胞的分化的防止， （5）细胞取得中微生物的去除； （6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力 要小；
二.培养系统
悬浮培养系统
机械搅拌式培养系统
Fujimura分离胡萝卜悬浮液
悬浮液
47μm膜过滤
滤液
31 μm膜过滤 收集
加入到10%~18%的Ficoll 加入等体积的培养基 网上细胞
180g离心5min
收集各法。低温处理可以提高培养体系中 细胞同步化的程度。 2、化学方法 1）饥饿法
悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分 裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1 或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养 基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会 同步进入分裂。
§4.植物细胞大规模培养与次生产物生产
§1.单细胞分离 完整的植物器官分离单细胞 由培养组织中分离单细胞
1-1、 机械法 第一种方法：用刀片刮叶片
撕去下表皮
露出叶肉细胞
用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉 过滤、离心
注意 ： 只有薄壁组织排列松散，细胞间结触 点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
2、固定化培养系统
细胞固定化培养技术按照其支持物不同可 以分为两大类：
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细
胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期的细胞。
常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿 嘧啶、羟基尿等。 3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度 一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。