植物细胞悬浮培养技术
2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
植物细胞悬浮培养技术
植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
第八讲植物细胞悬浮培养技术
第八讲：植物细胞悬浮培养技术摘要悬浮培养技术是一种在液态培养基中培育植物细胞的方法。
这种技术可以用于研究植物细胞的生理、生化、遗传和分子生物学。
本文将介绍悬浮培养技术的原理、方法和应用，并讨论其优缺点。
原理悬浮培养技术是将植物细胞悬浮在液态培养基中，并提供足够的营养和适宜的环境条件，促进细胞生长和分裂。
悬浮培养技术可以通过两种方法进行：自然悬浮和机械悬浮。
自然悬浮是指通过培养基中的液体流动和植物细胞的重力作用来保持细胞悬浮状态。
机械悬浮是指通过磁力搅拌或气泡强制产生的涡流来保持悬浮状态。
方法悬浮培养技术的方法主要包括以下步骤：1.选取适当的植物细胞：悬浮培养技术可以应用于多种植物细胞，例如培养基的类型和成分、植物物种、生长条件等，都会影响细胞的生长和分裂。
2.培养基制备：准备含有足够营养物质和适合生长的植物细胞的培养基。
3.细胞分离：使用细胞壁水解酶、酸碱处理或机械方法去除细胞壁，分离单个细胞。
4.细胞培养：将分离的细胞置于液态培养基中，将培养瓶放置拟南芥上，以恒定光照、温度、湿度和通风条件下日夜持续观察培养。
5.细胞传代：留置旺孔1cm左右的细胞，废弃周边细胞，再次培养。
应用悬浮培养技术可以应用于以下方面：1.生物医学研究：通过悬浮培养技术培养人类细胞，可用于药物筛选、治疗性细胞移植和组织工程学等研究。
2.分子生物学研究：由于悬浮培养技术能够大量培养植物细胞，因此可以用于高通量分析、基因克隆和表达、蛋白质组学和代谢组学研究等。
3.植物细胞与组织培养：悬浮培养技术可以用于植物组织和细胞的体外培养，利用悬浮培养技术可以大量制备植物生长激素和次生代谢产物。
优缺点悬浮培养技术有以下优点：1.可以大规模培养细胞。
2.可以简化分离和培养过程，使得实验成本低廉。
3.可以控制培养环境，减少外界干扰。
悬浮培养技术也存在以下缺点：1.悬浮培养技术对培养条件和营养要求非常苛刻，因此需要经验丰富的实验人员进行操作。
2.悬浮培养技术可能会产生细胞堆积的问题，从而影响细胞生长和分裂。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
植物细胞的悬浮培养技术
植物细胞的悬浮培养技术将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。
它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。
从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。
1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。
三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。
80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。
悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。
此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。
由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。
要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。
本实验仅介绍最常用的县浮培养技术。
一.实验原理：植物离体培养可产生愈伤组织。
将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。
良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
要建成这样的县浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。
然后经过培养基成分和培养条件的选择，并经多次断代培养才能达到。
县浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势，然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
[医学]植物细胞悬浮培养
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悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化： 同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
• 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态 ， 因此 ， 要达到完全同 步化是十分困难的。
• 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期 ， 这种差异使悬浮细胞分裂 、 代谢以及生理生化状态等复杂化。
• 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化 。 什么措施？
• 细细胞周期
• 细胞起始密度： 30～80个/室。
双层滤纸植板培养
• Horsch等 （ 198
培培养基基
培培养养细胞胞
转转移滤滤纸纸
培培养皿 饲养细胞层 看护滤纸
固体培养
• 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固 剂 ，经加热溶解后 ， 分别装入培养用的容 器中 ， 冷却后凝结成固体培养基。
• 优缺点
–简便易行 、所占空间小 –生长的不平衡 ， 易出现极化现象 – 易堆积生长过程中排出的有害物质 –有些生理生化指标测定不方便
150~250ml flask
100~ 120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
80 rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系特征
• 悬浮培养分散性良好 ， 细胞团较小 ， 一般 在30～50个细胞以下。
• 均一性好 ， 细胞形状和细胞团大小大致相 同 。悬浮系外观为大小均一 的小颗粒 ， 培 养基清澈透亮 ， 细胞色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色。
• 两阶段连续培养法
–于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该 培养基 ，而于第二反应器中投入生产培养基。
细胞悬浮培养
4.选择单细胞和小细胞团进行继代 选择单细胞和小细胞团进行继代
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注 射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 射器 ， 但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 胞和小细胞团（ 胞和小细胞团 （ (2-4 个细胞 ） ， 而不能通过大的 个细胞） 细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒， 细胞聚集体。 继代前应先使三角瓶静置数秒 ， 以 便让大的细胞团沉降下去， 便让大的细胞团沉降下去 ， 然后再由上层吸取悬 浮液。 浮液。
悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 物理方法和化学方法。 物理方法和化学方法。 物理方法主要是通过对细胞物理特性 物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细 主要是通过对细胞物理特性（ 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等） 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 进行选择的方法和低温休克法等。 进行选择的方法和低温休克法等。
5.4 细胞增殖的测定
1. 细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基， 细胞上沾着的多余水分，称重， 细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重 （fresh weight）。 weight）。
2.细胞干重 2.细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 在60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h，细胞干重恒 60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h， 定后，再称重。细胞干重（ weight） 定后，再称重。细胞干重（dry weight）以每毫升 培养物或每10 个细胞的重量表示。 培养物或每106个细胞的重量表示。
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植物细胞悬浮培养技术一、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
二、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子三、操作步骤1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。
所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。
2．水稻种子的消毒（1）将种子置于无菌的培养皿内，以体积分数95％的酒精消毒1～2min。
（2）取出后用无菌水冲洗2～3 遍。
（3）将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后，浸泡60min 。
（4）取出后用无菌水冲洗，将次氯酸钠溶液充分洗净。
3. 接种在超净工作台内，将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上，每个培养瓶接5～10 粒种子。
接种完毕后用封口膜将培养瓶封好，放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。
4．悬浮培养的开始：当得到愈伤组织后，将其转人到AA 液体培养基中。
注意愈伤组织块应小于3mm . 若组织块较大可用无菌解剖刀将其分割成小块。
液体培养基分装在250mL 的锥形瓶内．接种完毕后将瓶口用封口膜封好，把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。
调整摇床的旋转速度，使之为120r/min。
培养温度为26℃，在黑暗中培养。
5．悬浮培养物的保持进行悬浮培养后要不断进行观察，由于培养物的继代培养与培养瓶内培养物的密度及细胞生长速度有关，因此当发现培养瓶中培养物密度较大时，应及时用无菌的吸管吸取部分培养物到一新的50mL 培养基中继续培养。
同时还要及时淘汰一些大的组织团块和黄褐色的坏死组织。
一般每隔4～7d 就要继代一次。
植物组织培养技术2011-05-08 19:21第五章细胞培养教学目的：掌握植物单细胞培养与细胞悬浮培养的方法和技术，熟悉细胞培养的影响因素，了解细胞培养的应用。
教学重点：1、单细胞培养的方法与技术；2、细胞悬浮培养的方法与技术；3、悬浮细胞的同步化技术。
教学难点：细胞培养的影响因素及其生长调控。
教学内容：1、植物细胞培养：指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其繁殖的技术。
2、植物细胞培养的类型：（1）根据培养规模：分为小规模培养和大批量培养；（2）根据培养方式：分为悬浮培养、平板培养和看护培养；（3）根据要求的产物不同：分为诱变的细胞培养和生产次生代谢物的细胞培养。
第一节单细胞培养意义：在进行细胞株（种子细胞）的选择以及一些需要对细胞活动跟踪观察的情况下必须进行真正意义上的单细胞培养。
一、单细胞的分离：1、由培养组织中分离单细胞：（1）松散的愈伤组织：通过液体振荡培养、分离过筛获得，最常用；（2）幼胚、幼苗等：通过破碎、酶解等方法获得。
2、由完整植物器官分离单细胞：（1）机械破碎法：刀刮或研碎，如叶肉细胞特点：细胞不受酶毒害，无质壁分离，生活力强，但应用不普遍，仅适用于排列松散的植物组织。
（2）酶解法：果胶酶、纤维素酶特点：可获得大量游离细胞，但必须对细胞给予渗透压保护。
（3）化学方法：秋水仙素二、单细胞培养的方法：1、看护培养法：（1）方法：在固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，上放一小片滤纸（一般放置过夜），滤纸上接种细胞悬浮液，待细胞长出微小细胞团后直接转至琼脂培养基上让其迅速生长，即可获得单细胞无性系。
（2）特点：操作简便，易于成功，但不能在显微镜下观察。
2、微室培养：便于观察（1）方法：采用载玻片和盖玻片用石蜡油或其它物质密封做成微室进行细胞悬浮液的培养，待细胞团长至适当大小时转入新鲜半固体培养基上继续培养。
（2）特点：便于显微观察记录，但营养液容易变干，需及时转接。
3、平板培养法：应用最广泛（1）平板培养：指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。
（2）方法：将琼脂或琼脂糖培养基冷却至35℃左右（不凝固），与细胞悬浮液混合后进行植板（厚度约1mm），使细胞被包埋在固体培养基中形成一个平板，培养于25℃、黑暗的条件下。
（3）特点：筛选效率高、筛选量大、操作简单，且便于定位观察。
（4）效果：一般用植板率衡量植板率：指能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。
植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数×100%4、其它单细胞培养技术：（1）饲养层培养技术：加入饲养细胞混合后进行培养。
（2）双层滤纸植板培养技术：将饲养细胞与培养细胞用双层滤纸分离培养。
三、影响单细胞培养的因子：1、初始植板细胞密度：一般为1×103-1×105个/ml密度较高时对培养基成分要求相对较低，密度较低时对培养基成分要求相对较复杂。
2、培养基成分：一般需有机附加物。
第二节细胞悬浮培养一、细胞悬浮培养：1、概念：指将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。
2、意义：①在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换；②细胞状态可相对保持一致，利于进行各种遗传操作和生理生化活动的研究。
③为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
3、内容：①小细胞团培养；②单细胞培养；③原生质体培养。
二、悬浮培养的启动：1、种子细胞悬浮系的要求：细胞增殖速度快、有用成分含量高、分散程度大、再生能力强。
2、优良细胞株系的筛选方法：①从已经建立的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长较快、胚胎发生能力强的淡色愈伤组织；②采用振荡培养或酶解法得到更好的单细胞系或小细胞团；③培养后单细胞或小细胞团搁在固体培养基上进行培养；④挑选生长较快、生长良好的细胞株进行继代培养；⑤挑选各细胞系的培养物进行有效成分测定，筛选有效成分高而生长较快的细胞株作为种子细胞。
三、细胞悬浮培养的方法：（一）分批培养：1、分批培养：指在一个封闭的系统中进行的细胞悬浮培养，仅气体和挥发性代谢产物可同外界空气交换。
2、悬浮细胞的生长：细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈S形曲线，包括停滞期、对数生长期、直线生长期、减慢期和停止期5个时期。
注：①通过缩短继代的时间或是经过一些其他的处理使悬浮培养的细胞始终处在对数生长期；②加入条件培养基可以缩短停滞期的时间，使悬浮细胞快速恢复生长。
3、分批培养的方法：①旋转培养：培养容器呈360°旋转，转速②往返振荡培养：培养容器在一个方向上往返振荡；③旋转振荡培养：培养物在一个平面上进行旋转振荡，转速40-120r/min，如摇床培养；④搅动培养：培养物在搅棒的搅动下进行的培养。
4、分批培养的特点：细胞生长和培养基的成分都在不断地变化，对细胞生长和代谢的研究不利。
（二）半连续培养：1、指在培养容器中接种细胞并培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养进行交换的一种培养方法。
2、半连续培养的特点：①培养中不断补充培养基的营养成分，细胞可保持旺盛的生长；②培养中没有进行继代，细胞不会出现停滞期；③通过数次的、反复的操作达到生产细胞和有用物质的目的，简化了操作过程。
（三）连续培养：1、连续培养：指采用一定体积的但非密闭的生物反应器来进行大规模培养的方法，培养过程中不断排出旧的培养基、注入新鲜培养基，使其营养物质连续得到补充，细胞的生长和增殖连续进行。
2、连续培养的方法：（1）封闭式连续培养：指在连续培养中收集流出的细胞返回原培养体系进行培养的方法，培养中细胞数目不断增加，适合于非生长偶联型产物的生产。
（2）开放式连续培养：通过不断添加新鲜培养基，同时移去等体积的原培养液（内含培养细胞）来维持培养液体积不变，细胞始终维持在接近最高水平的一个稳定的数值上。
①化学恒定法：新鲜培养基的某一种营养液或成分被除调节成限制因子，并以恒定速率输入而建立一个恒定状态。
特点：通过营养物质的浓度来控制细胞增长的速率，适合于生长偶联型产物的生产。
②浊度恒定法：通过比浊计来测定培养液中的细胞混浊度，通过控制培养液的流入量使悬浮液浊度恒定。
特点：灵敏度高，适合于自动控制。
四、细胞悬浮培养基：1、常用基本培养基：B、ER5使用：仅适合于细胞的初始浓度大于5×104个/ml时，较低的细胞浓度需加入其他复合的有机成分。
2、细胞悬浮培养对培养基的需求特点：细胞的生长、分化或次生代谢物质的生产所要求的营养成分不同。
两步培养：先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物阶段后，再转入到产物合成培养基中进行培养生产次生代谢物质。
五、影响悬浮细胞生长的因素：1、起始愈伤组织的质量：增殖快、易松散、产量高2、接种细胞密度：一般为（0.5-2.5）×104个/ml3、培养条件：方式、温度、继代周期、振荡频率等六、悬浮细胞的同步化：1、物理方法：对细胞正常的生理生化代谢影响较小，但细胞获取量太少。
①电动离心分层法：不同分裂时期细胞的沉降速率不同；②温度处理法：低温抑制细胞分裂；③辐射处理法：使细胞在分裂前积累；④有丝分裂选择法：有丝分裂期细胞常变圆，易脱离生长表面。
2、化学方法：采用化学试剂抑制细胞生长①饥饿法：控制营养物质；②秋水仙碱法：阻抑有丝分裂；③抑制法：采用DNA合成的抑制剂，如5-氨基尿嘧啶氟尿嘧啶脱氧核苷等。