植物细胞悬浮培养技术
植物细胞工程的基本技术
植物细胞工程的基本技术植物细胞工程是现代农业中的核心技术之一，它可以利用生物技术手段，将基因信息引入植物细胞中，从而制备出具有新型特性的植物品种。
植物细胞工程的基本技术主要包括以下几个方面：一、植物细胞培养技术植物细胞培养技术是植物细胞工程的重要基础，它可以将植物细胞从植物体中剥离出来，形成原代培养体，在适宜的培养条件下进行细胞培养和增殖。
该技术主要涉及到组织培养、细胞培养、愈伤组织培养以及悬浮细胞培养等多个方面。
其中，愈伤组织培养是最基础的培养技术，它可以通过愈伤组织的再生和分化，为后续的遗传转化和基因编辑提供可行的细胞模板。
二、基因克隆与重组技术基因克隆与重组技术是植物细胞工程中非常关键的环节，这个技术主要涉及到将特定的基因序列放入植物细胞中的过程。
通过基因克隆和重组，可以将外源性基因导入到细胞质或者染色体的特定位置，并实现基因结构的调整，从而产生具有新型特性的植物品种。
三、基因转化技术基因转化技术是植物细胞工程最重要的技术之一，它可以将基因克隆和重组的结果导入植物细胞中，并实现基因的表达。
基因转化技术主要分为两个类别：生物学的和物理学的。
其中，生物学的方法包括农杆菌介导的转化和农杆菌外介导的转化，物理学的方法包括基因炮和电穿孔等。
四、基因编辑技术基因编辑技术是近年来兴起的一种先进技术，它可以利用生物技术手段修改基因序列，从而实现有针对性的基因改造。
目前，基因编辑技术主要包括ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等多个基因编辑工具。
通过这些工具，可以实现基因串联、点突变等操作，并为后续的育种和遗传转化提供更多的技术手段。
总之，植物细胞工程是现代农业中的重要技术，它可以帮助我们制备出更具有良好农业生产性能的植物品种。
通过不断的技术创新与发展，相信我们能够在农业生产中发挥出更大的作用，并实现更好的农业可持续发展。
植物细胞培养
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
植物细胞悬浮培养的影响因素
植物细胞悬浮培养的影响因素吴春霞(山东师范大学生命科学学院逆境植物重点实验室,山东济南250014)摘要 综述了植物愈伤组织诱导以及悬浮细胞培养的影响因素。
关键词 悬浮细胞;愈伤组织;诱导;培养条件中图分类号 S 336 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)01-00036-03Influencing F acto rs o n the Culturing o f P lant Suspension Cell WU C hu n -x ia (Key Laboratory of Plant Stress Research,C ollege of Life Science,Shandong Normal Uni versi ty,Jinan,Shandon g 250014)Abstract The ai m of this stud y was to su mm arize the in fluence factors on in ducing callus and suspension cell cultu re.Key w ords Susp en si on cell;Callus;Inducemen t;C ulturi ng condi tion基金项目 山东省高等学校优秀青年教师国内访问学者项目。
作者简介 吴春霞(1973-),女,山东淄博人,博士,讲师,从事植物抗逆分子遗传学方面的研究。
收稿日期 2008-10-22植物细胞悬浮培养是指植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中,于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的聚集体来自愈伤组织,某个器官或组织,甚至幼嫩的植株,通过物理或化学的方法进行分离而获得。
与传统的整株材料相比,植物细胞悬浮体系由于其分散性好、细胞形状及细胞团大小大致相同,而且生长迅速、重复性好、易于控制等有利因素[1],被广泛用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究。
植物细胞的大规模培养
影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量
接种细胞密度 培养条件：方式、温度 继代周期
细胞生长情况分析测定方法：
1、细胞计数：单位体积细胞浓度；
2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 4、有丝分裂指数：有丝分裂细胞占总细胞的百分数
细胞活力测定
质不断补充，细胞保持在增值最快的对数生长期
封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加 开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获 半连续培养：新鲜培养液每隔一段时间添加，用过的培养液平衡排 出，营养物质不断补充
细胞培养同步化：
1、物理法
1）体积分选 2）冷处理法 2、化学法
1）饥饿法
植物细胞固定化的技术
按其支持物可分为两大类： 1.包埋式： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺
维
悬浮培养
悬浮培养优点：
增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营
养供应
避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而
对细胞自身产生毒害
保证氧气的充分供应等。
悬浮细胞培养的类型有：
成批培养：只有一定的气体交换，营养物质耗尽，细胞和产物一次 性收获。
连续培养：新鲜培养液连续添加，用过的培养液平衡排出，营养物
特点：细胞固定，而培养液循环流动
细胞固定化意义（优点）：
1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。
2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 4）有利于进行连续培养和生物转化。
贴壁培养与悬浮培养的区别
6 生长过程
潜伏期：悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形。贴附底物。有运动活 动,基本无增殖, 少见分裂相。 指数增长期：是细胞增生最活跃、 活力最旺盛的阶段培养物中细胞数 量呈指数增长,细胞群体均一。 停滞期：细胞数量达饱和密度后， 细胞遂停止增殖，进入停滞期。
7 传代培养
贴壁细胞 酶消化法传代：弃去培养液，加胰酶消化，加培 养液终止胰酶作用，离心，去上清，吹打成悬液， 分装传代。 悬浮细胞 离心法传代：离心，弃上清液，加新鲜培养基， 分装传代。 直接传代法：待细胞沉淀，倾去1/3-2/3培养液， 用吸管吹打形成细胞悬液再传代。
贴壁培养
悬浮培养
适合包括原代细胞在内的大多数细胞类 型
适合已适应悬浮培养的细胞以及其他一 些无粘附性的细胞
需要定期传代，但是易于通过倒置显微 镜观察。显微镜下观察形态多种。晃动 培养液时，细胞不动 利用酶或机械方法解离细胞 需要使用经过组织培养处理的容器
较易传代，但是需要每天进行细胞计数 和存活率测定。显微镜下观察呈圆形。 晃动培养液时，细胞也随着漂动 无需通过酶或机械方法解离细胞 可使用未经组织培养处理的容器，但需 进行搅动以便进行充分的气体交换 可批量收获产物，用于蛋白质的大量生 产及多种研究领域
可连续收获产物，用于细胞学研究等多 种研究领域
细胞生长受表面积限制
细胞生长受培养基中浓度的限制
悬浮细胞培养
温度
植物悬浮细胞系：23-27℃
pH
哺乳动物系：7.0-7.4 成纤维细胞系：7.4-7.7
植物细胞：5.6-6.0
培养基
需血清
悬浮培养基可不需血清
5 细胞形态
贴壁培养细胞：成纤维细胞型 上皮细胞型 游走细 胞型 多型细胞型 悬浮培养细胞：悬浮型
植物细胞培养的基本流程
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胡萝卜肉质根细胞的悬浮培养和不定芽的诱导(实验报告)
根愈伤组织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养 以分离得到单细胞[5]。 （3）胡萝卜肉质根愈伤组织再分化培养 将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000～2000Lx 条件下诱导胡萝卜愈伤组织再分化成苗（或丛芽）[6]。 （4）培养结果 文字描述配合图片记录培养结果 Ⅳ、镜检 用无菌尼龙滤网将培养物滤去。除去滤网上的愈伤组织碎块和大的细胞团。留 下胡萝卜细胞液，用滴管吸取一滴在培养皿上，用台盼蓝染色，然后置于倒置显微 镜下观察。也可以做成临时装片进行观察。
2． 实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理
1） 、将继代一次的胡萝卜愈伤组织选择生长状态良好、色泽新鲜未褐化的部分转接 到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖[1]。 2） 、一般情况下，适合于愈伤组织增殖的培养基也适合于细胞的悬浮培养，只是要 把琼脂去掉。 3） 、影响茎芽分化因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例。当生长 素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较 高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时[2]，则仍产生无结构的愈伤 组织。 4） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构松散的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养[3]，即可 分离得到单细胞，进一步可建立胡萝卜细胞悬浮培养系。 5） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000~2000Lx 条件下即可分化再分化成苗（或丛芽） 。
悬浮细胞培养
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
8
继代
9
② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
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③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
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①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
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植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
1 诱导产生愈伤组织 2 愈伤组织反复继代，使组织 不断增殖，提高愈伤组织的松 散性；
植 物 细 胞
培
养
技
术
植物细胞培养的过程：
愈伤组织 或其它分散细胞 继代培养 细胞群体 扩大培养 发酵技术
单个 悬浮培养 细胞 悬浮细胞
筛选 优良的 无性繁殖系 细胞代谢产物 分离提纯
1、单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞
由培养组织（如愈伤组织） 中分离单细胞
叶片是分离单细胞的最好材料
继代
悬浮
摇床用于振荡
3 悬浮培养：将愈伤组织 在液体培养基中培养，建立 优点：细胞团成小 细胞团或单细胞； 悬浮培养物 在培养基中均匀分 布；有空气交流。
愈伤组织
悬浮培养
4、悬浮继代培养
分批培养 连续培养
分批培养
继代
连续培养 加入培养基
二者体积相等
排出培养基及其培养物
分：开放式连续培养 封闭式连续培养
• 细胞次级代谢产物： • 植物生长到一定时期，由次 级代谢产生的一类细胞生命活动 或生长发育正常进行的非必需的 不分子有机物。
培养基
含用化学成分还不清楚或化学 成分不恒定的天然有机物
按 成 分 不 同 划 分
天然培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁 培养基 化学成分完全了解的物质配制 而成的培养基 高氏1号培养基、查氏培养基
当细胞分裂素和生长 素共同使用时，能刺激 愈伤组织的形成，而通 过调节二者的浓度比， 就可以调控植物细胞培 养过程中芽和根的形成， 称为“激素杠杆”。
生 长 素
根 芽
细胞分裂素
在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和 实验人员的无菌操作？
植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成 分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以 在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象 经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌 不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程 中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速 死亡。
切取 形成层 移栽
无菌 接种
脱分化
诱导愈伤组织 的形成
培养室
再分化 试管苗的形成
植 物 组 织 培 养
6 5
再分化
(愈伤组织) 4 脱分化
1
3
2
脱分化
就是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去 其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的 过程。
脱分化的实质和结果分别是什么？ 实质是恢复细胞的全能性过程。 结果是形成愈伤组织。
合成培养基
半合成培养基
纯化学试剂和天然物质配制而 成的培养基
在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体 状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0% 按 物 理 状 态 不 同 划 分
固体培养基常用来进行微生物的分离、 鉴定、活菌计数及菌种保藏
固体培养基
琼脂含量一般为0.2%-0.7% 半固体培养基 观察微生物的运动特征、分 类鉴定
5、继代培养最佳继代时期：
选择指数生长期和直线生长期。
细胞生长曲线：呈S形曲线 1 2
培 养 细 胞 数 目
滞后期 （微生物又叫适应期）
5
4 3
1 2
指数生长期 （微生物又叫对数期）
3 直线生长期 4 5
培养时间
减慢期
静止期 （微生物又叫稳定期）
• 6、植物细胞培养的意义：
• 1）不受地理、季节和气候条件的限制； • 2）节省土地，降低成本，生产周期短，可大大提 高经济效益；不污染环境 • 3）可代替整体植株在工厂内连续生产所需产物； • 4）可通过添加抑制剂等使生物合成按照人的意志 进行； • 5）可通过诱变筛选，获得高产细胞株，并且可以 进行特定的生物转化获得新的有用物质。
愈伤组织
原指植物体受伤时产生 于伤口周围的组织。现 多指切取植物体的一部 分，置于含有生长素和 细胞分裂素的培养液中 培养，诱导产生的无定 形的组织团块。
菠萝的愈伤组织
愈伤组织的特点 排列疏松、高度液泡化的无定形状态薄壁细胞团 再分化： 脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分 化成根或芽等器官的过程。