实验四 植物细胞悬浮培养与同步化
植物细胞的大规模培养
影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量
接种细胞密度 培养条件：方式、温度 继代周期
细胞生长情况分析测定方法：
1、细胞计数：单位体积细胞浓度；
2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 4、有丝分裂指数：有丝分裂细胞占总细胞的百分数
细胞活力测定
质不断补充，细胞保持在增值最快的对数生长期
封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加 开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获 半连续培养：新鲜培养液每隔一段时间添加，用过的培养液平衡排 出，营养物质不断补充
细胞培养同步化：
1、物理法
1）体积分选 2）冷处理法 2、化学法
1）饥饿法
植物细胞固定化的技术
按其支持物可分为两大类： 1.包埋式： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺
维
悬浮培养
悬浮培养优点：
增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营
养供应
避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而
对细胞自身产生毒害
保证氧气的充分供应等。
悬浮细胞培养的类型有：
成批培养：只有一定的气体交换，营养物质耗尽，细胞和产物一次 性收获。
连续培养：新鲜培养液连续添加，用过的培养液平衡排出，营养物
特点：细胞固定，而培养液循环流动
细胞固定化意义（优点）：
1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。
2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 4）有利于进行连续培养和生物转化。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养一、实验目的及意义植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。
由于培养的细胞对外界的各种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分子生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。
通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。
烟草（Nicotiana tubacum Linn.）为茄科经济作物，同时也是植物分子生理生化研究一种重要的模式植物。
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。
二、实验原理植物细胞悬浮培养（plant cell suspension culture）是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。
用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。
本实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。
植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。
所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液中的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基中均匀分布，有利于培养基与细胞间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面之间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的排除。
三、实验仪器与药品超净工作台，恒温振荡器（摇床），高压灭菌锅，培养室（培养箱），封口膜，油性标记笔，无菌蒸馏水四、实验材料烟草愈伤组织五、操作步骤与方法将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后冷却。
2.培养前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
植物细胞培养(Plant cell culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
低温处理 提高培养体系中细胞同步化的程度
第二节 单细胞培养
细胞平板培养(cell 细胞平板培养(cell plating culture) 植板率: 植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例. 细胞中所占的比例.
看护培养(nurse 看护培养(nurse culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
分选法 通过细胞体积大小分级, 通过细胞体积大小分级,直接将处 于相同周期的细胞进行分选, 于相同周期的细胞进行分选,然后将同 一状态的细胞继代培养于同一培养体系 中. 梯度离心法 流式细胞仪
四、悬浮培养细胞的同步化
饥饿法 饥饿导致细胞分裂受阻, 饥饿导致细胞分裂受阻,使细胞不能合成 DNA,即不能进入S DNA,即不能进入S期;或细胞分裂不能进 行,即不能进入M期. 即不能进入M 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞, 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使 细胞滞留在DNA合成前期, 细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制 后,即可获得处于同一细胞周期---G1期的 即可获得处于同一细胞周期---G 同步化细胞. 同步化细胞.
三、悬浮细胞的生长动态
生长呈S 生长呈S形生长曲线 起始密度(x 起始密度(x0):0.5x105-2.5x105 生长速率(p) 生长速率(p) p=(lnxp=(lnx-lnx0)/t 单位体积细胞重量 鲜重:按一定体积取样, 鲜重:按一定体积取样,经真空过滤后称重 干重:真空过滤后, 80℃条件下烘干细 干重:真空过滤后,在80℃条件下烘干细 胞至恒重
植物细胞规模化培养体系的建立
半连续培养(semi半连续培养(semi-continuous culture) 两步培养法 生长培养基 合成培养基
实验：植物细胞的悬浮培养技术
• • • •
三、实验器材与材料
• 器材 • 超净工作台，酒精灯，镊子，高压灭菌锅
• 材料 前面实验诱导的豇豆的愈伤组织。
四、实验方法
• 1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织(注意愈 伤组织的选择)，放入试管中并轻轻夹碎。 • 接种密度：每毫升培养基接0.1克愈伤组织。以保 证最初培养物中有足够量的细胞。 • 2.将已接种的试管置于旋转式摇床上。在 100r/min，25~28℃条件下，进行振荡培养。
• 3.经6—10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养 瓶中加新鲜培养基4ml，必要时，可用移液管将培 养物分装成两管，继续培养。 • （若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当， 应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）。可 进行第一次继代培养。
五、注意事项： 注意事项：
• 1.上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、 器皿等要高压灭菌后方可使用。 2.如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污 染。 • 3.实验报告每人写一份。实验讨论部分记 得首先评价自己之前培养的愈伤组织的生 长情况。
植物细胞的悬浮培养技术
一、实验目的
• 1.掌握植物悬浮细胞系建立的方法，原理。 • 2. 巩固组织与细胞培养的无菌操作技术。
二、实验原理
• • 将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进 行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。 植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈伤组织 县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散县浮培养物。 良好的县浮培养物应具备以下特征： （1）主要有单细胞和小细胞团组成； （2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快； （3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们 多呈等径形，核质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
植物细胞悬浮培养(组培实验报告)
3、 继代培养。 （由于时间关系以及条件有限， 本次实验只进行了一次悬浮培养） 在接种两个星期之后继代。继代方法是：先用孔径为 100um 的无菌尼龙滤筛 将培养物滤去。除去滤筛上的愈伤组织碎块和大的细胞团。
4、通过镜检查看实验结果。 用一定规格的无菌尼龙滤筛将培养物过滤，滤出含单细胞的液体盛于一洁净 的培养皿内。在倒置显微镜下观察单细胞。 （理论上还应对培养物中进行单细胞计数以及活力测定，但因条件有限，未 能完成。这是本次实验的一大遗憾。 ）
罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半 连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。 连续培养(continuous culture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基， 排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的 现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖 速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。 （4）细胞悬浮培养的培养基 从理论上讲，能形成生长快、疏松愈伤组织的培养基一般来说也同样适用于建 立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。旺盛生长的悬浮培养物中， 无机磷酸盐迅速地被利用，以致使无机磷酸盐成为了一个限制生长的因素。此 外，培养基的 pH 值和启动密度也是不容忽视的。pH 值可能随细胞生物产量的 增加而改变。需要监测和调整悬浮培养物中的 pH 值。启动低密度细胞培养时， 要条件培养基。 （5）由悬浮细胞再生植株的途径：由悬浮细胞直接形成体细胞胚：先将悬 浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。 由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结 构，称为胚状体。胚状体方式：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴 的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体形成在植物有性生殖中，精子和卵结 合形成合子， 合子进一步发育成胚。 但在组织培养条件下胚状体的发育过程是： 细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心 形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。在生长素比细胞分裂 素比值高的时候使细胞进行增殖。水解酪蛋白属于铵态氮，对胚状体诱导起重 要作用。 （6）悬浮培养中细胞生长的测定常用方法： 细胞计数、细胞密实体积(packed cell volume,PCV)、细胞鲜重、 重、细胞有丝分裂的指数。 （7）培养细胞活力的测定常用方法： 相差显微术法、四唑盐还原法(TTC 法)、荧光素二乙酸酯法(FDA 法)、伊凡蓝 染色法。 细胞干
细胞悬浮培养的方法和特点1
生长曲线
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量 细胞计数 细胞密实体积 细胞重量
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量
4.1 细胞计数 虽然悬浮培养细胞比较分散，但远没有达到单 细胞分散的水平，因此，需要采用方法使细胞 团分散成为单细胞才能够进行细胞计数。 使细胞团分散的方法有两种，即铬酸法和果胶 酶法。分散后，在显微镜下计数。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量
例，铬酸法的实验方法 取1份培养细胞（用滤纸吸除表面水分）
加入2份容积的8%的三氧铬酸溶液中，在70 C 加热5-15分钟；冷却后用力振动10分钟分散细 胞团成为单细胞，然后用血球计数板在显微镜 下计数。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
3，细胞悬浮培养的特点
3.1 不用使用琼脂等培养基固化剂，不仅减少 成本而且能使培养结果不受固化剂中杂质的影 响。 3.2 便于更换培养基的操作，借此可以减少人 工劳力。 3.3 在液体培养条件下植物组织失去了生长的 方向性。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
1，细胞悬浮培养的方法
摇床有两种摇荡的形式，一种是往复式的（来回 移动，运动面上的每一个点的轨迹都是一条直 线），另一种是涡旋式的（不是旋转，运动面上 的每一个点的轨迹都是一个直径相同的圆圈）。 衡量摇床工作状态的两个参数是每分钟的摇荡频 率和摇荡的位移距离。此外，运转是否平稳和承 载重量是购买时需要考虑的指标。
第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
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实验五植物细胞悬浮培养与同步化
一、实验目的与意义
学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法。
植物离体细胞作为生物反应器具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰，而且产量高、化学稳定性和化学特性好等特点，利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者们的重视，也有成功的先例。
同时，研究发现，离体培养条件下，细胞系的种类以及培养条件、培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度对目的产物的产量有很大的影响。
二、基本原理
利用固体培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变。
而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般用100～12Or/min 的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
三、实验器材
超净工作台、震荡摇床、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、镊子、锥形瓶、各种接种工具、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机
四、实验药品
培养基母液、2，4-D、蔗糖、琼脂。
五、实验步骤
1、诱导愈伤组织形成。
2、制备液体培养基：MS+2，4-D 1mg/L+蔗糖3%
3、在超净工作台上，从形成愈伤组织的培养瓶中，挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织、放
入盛有30ml液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻捏碎愈伤组织。
每瓶接入约2g重的愈伤组织，置于震荡摇床固定，在黑暗条件下或弱散射光下100r/min震荡培养。
4、将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中（孔径47
μm，81μm或更大）。
5、如果网眼被细胞团堵塞，可用吸管反复吸、吹。
6、再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。
7、重复步骤4~6。
8、将通过较大孔径的细胞悬浮液，再通过较细孔径的尼龙网过滤（如31μm，26μm），用吸
管反复吸、吹。
9、经过分级过滤的“同步化”细胞离心（50g，5分钟），收集后加入液体培养基进行培养或
进一步同步化。
六、思考题
1、研究细胞悬浮培养的意义何在？挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题？
2、建立细胞悬浮系的步骤包括哪些？一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征？。