植物细胞悬浮培养
2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
植物细胞悬浮培养
植物细胞悬浮培养一、目的要求了解植物细胞悬浮培养的基本原理，通过实验掌握植物细胞悬浮培养的方法和技术。
通过实验练习和巩固无菌操作技术。
二、基本原理利用固体琼脂培养基离体培养植物组织的方法已广泛应用于植物遗传实验中。
但是，这种方法在某些方面仍有不足之处。
比如在培养的过程中，植物愈伤组织的营养成分和植物组织产生的代谢产物呈梯度分布，琼脂本身也有一些未知的物质可能会影响培养。
这将导致植物组织生长发育过程中的代谢变化，使用液体培养基可以克服这一缺点。
当植物组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层振荡培养或通气来提高培养基中的供氧量。
植物细胞悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中，在培养过程中能保持良好的分散性。
这些小细胞聚集体通常来自植物愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在传代培养中，应去除较大的细胞团块和接种物残留物。
如果从植物器官或组织建立细胞悬浮培养系统，它包括愈伤组织诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前，该技术已广泛应用于细胞形态、生理、遗传和凋亡的研究，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
将转化的植物细胞诱导分化形成植株，并获得携带目的基因的个体。
三、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子四、操作步骤1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
植物细胞的悬浮培养技术
植物细胞的悬浮培养技术将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术，称为植物细胞悬浮培养。
它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。
从50年代起，米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。
1958年斯图尔德（F.C.Steward）等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。
三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大空量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培养。
80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。
悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础。
此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养，体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。
由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，而是大多以细胞团的形式存在，至今还不能培养完全是单细胞的县浮液。
要进行单细胞培养或选择细胞无性纱，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。
本实验仅介绍最常用的县浮培养技术。
一.实验原理：植物离体培养可产生愈伤组织。
将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散县浮培养物。
良好的县浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力，增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征，它们多呈等径形，核一质比率大，胞质浓厚，无液胞化程度较低。
要建成这样的县浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。
然后经过培养基成分和培养条件的选择，并经多次断代培养才能达到。
县浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势，然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。
植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选
第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。
二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件：①细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。
很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。
②均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。
在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。
③液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2〜3天生长量可增加一倍。
植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。
因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。
三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。
图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1.选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。
有的基因型容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。
但有的基因型则与之相反。
因此，要重视起始材料基因型的筛选。
（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。
悬浮细胞培养
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
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继代
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② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
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③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
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主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
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悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
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①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
[医学]植物细胞悬浮培养
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化： 同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
• 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态 ， 因此 ， 要达到完全同 步化是十分困难的。
• 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期 ， 这种差异使悬浮细胞分裂 、 代谢以及生理生化状态等复杂化。
• 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化 。 什么措施？
• 细细胞周期
• 细胞起始密度： 30～80个/室。
双层滤纸植板培养
• Horsch等 （ 198
培培养基基
培培养养细胞胞
转转移滤滤纸纸
培培养皿 饲养细胞层 看护滤纸
固体培养
• 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固 剂 ，经加热溶解后 ， 分别装入培养用的容 器中 ， 冷却后凝结成固体培养基。
• 优缺点
–简便易行 、所占空间小 –生长的不平衡 ， 易出现极化现象 – 易堆积生长过程中排出的有害物质 –有些生理生化指标测定不方便
150~250ml flask
100~ 120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
80 rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系特征
• 悬浮培养分散性良好 ， 细胞团较小 ， 一般 在30～50个细胞以下。
• 均一性好 ， 细胞形状和细胞团大小大致相 同 。悬浮系外观为大小均一 的小颗粒 ， 培 养基清澈透亮 ， 细胞色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色。
• 两阶段连续培养法
–于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该 培养基 ，而于第二反应器中投入生产培养基。
药用植物细胞悬浮培养的研究进展
药用植物细胞悬浮培养的研究进展[通信作者] *高文远，Tel/Fax：（022）87401895，E-mail：pharmgao@1934年，White首次成功地进行了植物细胞的体外培养。
1939年，White和Gautheret首次用实验方法建立了植物组织和器官的人工无菌培养技术。
1940—1976年，科学家们开展了大量的工作进行培养基的筛选和培养方法的探索，使植物细胞和组织培养技术发展成一门精细的实验科学，在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面已经建立了一套标准的操作程序。
1956年，第一个应用细胞培养技术生产天然产物的专利诞生了。
到目前为止，通过药用植物细胞培养研究过的药用植物超过400种，从培养细胞中分离到的次级代谢产品在600种以上，其中60多种药用植物代谢物含量超过或等于原植物的含量。
药用植物细胞培养研究的大部分内容是通过高产组织或细胞系的筛选与培养条件的优化等，以期降低成本及提高次生代谢产物的产量，或者通过对次生代谢产物生物合成途径的调控来达到相同的目的[1]。
同时，许多科学家向药用植物工业化培养方面进行了不懈的努力。
1 药用植物细胞悬浮培养条件的优化1.1 药用植物悬浮细胞培养中物理因素的优化对于药用植物悬浮细胞培养来说，环境中的许多物理因素对细胞的生长、目标次生代谢产物的合成具有很大的影响。
如温度、光照、pH、电场、磁场、电磁辐射、机械力以及超声波等在药用植物悬浮细胞培养过程都有着十分重要的作用。
在药用植物组织培养中，通常培养温度控制在20～28 ℃，最适温度为（25±2）℃[2]，但不同植物的最适温度不同，且植物细胞生长和次生代谢产物的合成所需的温度很多时候并不一致，因此选择合理的培养温度并进行相应的调控对于细胞生长以及产物合成十分关键。
Hoopen等[3]曾对长春花Catharanthus roseus细胞的培养过程，Takeda等[4]对草莓细胞的培养过程分别进行温度的阶段性调控，结果都在很大程度上提高了产物的产率。
植物细胞的悬浮培养技术
毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。