镰形艾美耳球虫感染早期对小鼠的致病性研究

镰形艾美耳球虫感染早期对小鼠的致病性研究贾妮娜;袁顺子;车丽霞;张丽萍;杨雯;任超【摘要】为研究镰形艾美耳球虫感染早期对小鼠的致病性,将镰形艾美耳球虫经口感染小鼠,同时设立无球虫感染空白对照组.通过观察各组小鼠的临床症状,感染36 h后剖检的眼观病变,以及各个脏器的病理组织学观察和盲肠免疫组化观察,来研究感染早期镰形艾美耳球虫对小鼠的致病性.结果表明:早期感染镰形艾美耳球虫主要破坏肠道的黏膜组织,导致黏膜上皮和腺上皮细胞变性、坏死、脱落,黏膜下层水肿,炎性细胞浸润至黏膜层,对其他脏器未造成可见的病理损伤;免疫组化观察,发现早期感染镰形艾美耳球虫也主要侵染黏膜层和黏膜下层.因此,镰形艾美耳球虫仅感染小鼠的盲肠,不感染其他器官,可以作为候选的疫苗载体.【期刊名称】《天津农学院学报》【年(卷),期】2018(025)001【总页数】5页(P54-58)【关键词】镰形艾美耳球虫;致病性;小鼠;器官指数;免疫组化;病理组织切片【作者】贾妮娜;袁顺子;车丽霞;张丽萍;杨雯;任超【作者单位】天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津300384【正文语种】中文【中图分类】S852.72+3研究发现，艾美耳球虫生物安全性较高，寄生宿主的特异性强，遗传性状稳定，通过人工转染能够表达外源抗原，可持续传代并稳定表达目的抗原，激发局部黏膜免疫和系统性免疫反应[1-2]。

鉴于艾美耳球虫具有上述优势，在禽免疫学上已利用柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）作为抗原载体，研究外源抗原被有效运送、递呈，进而产生保护性免疫应答的细胞与分子生物学机制[3-5]。

感染哺乳动物的球虫，如感染家兔的斯氏艾美耳球虫（Eimeria intestinalis），也可以作为抗原载体通过人工转染途径稳定表达外源抗原[6]。

目前已发现的鼠球虫有15种，镰形艾美耳球虫（Eimeria falciformis）是其中的一种，它主要感染小鼠盲肠和结肠的黏膜组织[7]。

镰形艾美耳球虫能够在小鼠体内大量繁殖，未来有望成为一类新型疫苗载体，具有广阔的应用前景。

因此，本研究通过建立镰形艾美耳球虫感染小鼠的动物模型，研究感染早期镰形艾美耳球虫对小鼠各个脏器的致病性，以及镰形艾美耳球虫抗原的组织分布，为新型兽用疫苗载体的研究提供新的研究思路。

1.1.1 试验动物昆明系小鼠60只，购自天津医科大学实验动物中心，9 周龄，体重为（25±2）g，饲料充足，饮水不限，分笼饲养，室温，湿度适宜。

1.1.2 主要试剂生物素标记的山羊抗鸡IgY二抗购自艾美捷科技有限公司；HRP标记的链霉卵白素复合物购自北京鸿跃创新科技有限公司；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司。

1.1.3 虫株镰形艾美耳球虫由中国农业大学国家动物寄生原虫实验室赠予，天津农学院基础兽医学实验室保存。

1.2.1 试验动物分组与处理将9周龄雌性清洁级昆明小鼠20只分成2组，每组10只，试验组小鼠经口感染镰形艾美耳球虫5×104个/只，对照组灌服等量生理盐水。

感染后观察并记录各组小鼠的精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄、死亡等临床症状。

1.2.2 剖检与病理组织学观察将感染36 h后的小鼠剖检，观察各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、盲肠的病变情况，计算器官指数（各脏器重量与体重之比）。

采集各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、盲肠组织，用4%甲醛溶液进行固定，经过7 d的组织固定，将各组小鼠的脏器进行常规病理组织切片制备与HE染色，光镜下观察各脏器的病理变化。

“-”表示无病变，“＋”表示轻度损伤，“＋＋”表示中度损伤，“＋＋＋”表示重度损伤。

1.2.3 免疫组织化学观察石蜡切片按常规进行脱蜡处理至蒸馏水，之后PBS洗3次，每次5 min；5%双氧水室温避光孵育20 min，去除内源性过氧化物酶，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清室温封闭30 min；弃去血清，滴加鸡抗镰形艾美耳球虫全抗原一抗（工作浓度为1∶2 000），37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素标记的山羊抗鸡IgY二抗（工作浓度为1∶1 000），37 ℃孵育1 h，之后PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP标记的链霉卵白素复合物，37 ℃孵育30 min，之后PBS 洗3次，每次5 min；滴加DAB显色液，室温显色10 min；用蒸馏水终止显色；放入苏木素中复染30 s；蒸馏水冲洗后盐酸酒精分色10 s；自来水反蓝5 min；按HE染色步骤进行脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.4 统计与分析应用SPSS11.5软件采用T检验法对试验数据进行统计分析处理，利用Excel软件制作表格，以（±SD）表示。

在感染镰形艾美耳球虫36 h内，试验组与对照组小鼠的精神、活动、食欲、排泄、皮毛等临床症状均无异常。

感染36 h后剖检观察各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏，试验组与对照组相比，各脏器的形状、大小与色泽均正常，未见病变情况，且各脏器的器官指数差异不显著（表1）。

对盲肠剖检，观察可见试验组黏膜肿胀、有少量出血点，黏膜表面覆盖多量黏液。

试验组与对照组相比，小鼠的盲肠指数差异显著（表1）。

感染36 h后试验组与对照组相比，小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏的病理组织学观察未见异常，差异不显著（表2，图1A-H）。

感染36 h后试验组与对照组相比，试验组小鼠的盲肠黏膜上皮和腺上皮变性、坏死、脱落，大量炎性细胞浸润，黏膜下层水肿、增宽，对照组的病理组织学观察未见异常（表3，图1I-J）。

感染36 h后试验组与对照组相比，镰形艾美耳球虫阳性区域主要分布在黏膜上皮、固有层、黏膜下层和肠腔中，对照组未见镰形艾美耳球虫阳性区域（图2）。

说明镰形艾美耳球虫在早期主要侵染小鼠盲肠的黏膜层和黏膜下层。

镰形艾美耳球虫隶属于顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoasida）、球虫亚纲（Coccidiasina）、真球虫目（Eucoccidiorida）、艾美耳亚目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeriidae）、艾美耳属（Eimeria），潜隐期为7 d，症状明显期10～16 d[7-8]。

卵囊经口感染后，先在体内进行无性生殖，感染16 h后，盲肠和结肠的肠腺上皮细胞内含有成熟的第一代裂殖体；感染32 h后，盲肠和结肠的肠腺上皮细胞内有第二代裂殖体[8]。

研究发现，感染36 h后，镰形艾美耳球虫的虫体不断进行无性繁殖，对盲肠的肠黏膜造成损伤，导致黏膜上皮和腺上皮细胞变性、坏死、脱落，黏膜下层水肿，炎性细胞浸润至黏膜层（图1I-J）。

对于其他器官，没有发现眼观和镜检的可见病理变化（图1A-H）。

免疫组化观察，发现镰形艾美耳球虫早期感染也主要侵染盲肠的黏膜层和黏膜下层（图2）。

这些都与前人的研究相符合，说明镰形艾美耳球虫早期感染的主要部位是盲肠，造成小鼠肠道黏膜层的严重损伤，其他器官不存在损伤，可以作为候选的疫苗载体进行研究。

艾美耳球虫用作疫苗活载体具有以下几方面优势：第一，相对于病毒和细菌，艾美耳球虫基因组较大，约60 Mb[9]，可供外源基因插入的潜在位点较多。

Su等利用piggyBac转座子对柔嫩艾美耳球虫进行转染，获得了稳定转染球虫群体，并且通过genome-walking的方法发现插入位点具有TTAA特征，进一步从基因水平解析球虫作为疫苗载体的价值[10]。

第二，艾美耳球虫是真核生物，可以像宿主细胞对表达出的外源蛋白进行化学化修饰，而不影响蛋白的抗原活性。

Kurth等对大鼠尼氏球虫（Eimeria nieschulzi）进行了体外瞬时转染和体内稳定转染，并利用柔嫩艾美尔球虫的MIC-1调控序列实现了黄色荧光蛋白和药物筛选基因DHFR在鼠球虫中的转染[11]。

第三，球虫活卵囊疫苗已经商品化，能够激发宿主产生良好的群体免疫保护效果（保护率＞90％[12]）。

第四，球虫疫苗可口服接种，简单易行，适用大规模的群体饮水或拌料免疫。

第五，球虫的繁殖周期较短，感染属于自限性，在生成卵囊以后即排到体外，不会引起免疫耐受问题，且生物安全性较高，不存在跨种间传播的威胁，田间应用时也不会出现所谓“散毒”的局面。

第六，球虫寄生于肠上皮细胞内，不同阶段虫体对肠黏膜上皮细胞反复入侵，能激发宿主产生较强的黏膜免疫和细胞免疫应答，不仅能够激发宿主对球虫表达的外源蛋白产生免疫反应，而且也能使宿主产生针对球虫自身的免疫反应，起到一苗多用的效果[1-4]。

此外，艾美耳球虫感染能够激活宿主肠道上调TLR1LA、TLR3、TLR4、TLR5、TLR15、TLR21的表达，并启动 MyD88 信号通路来诱导先天性免疫应答[13-15]。

因此，艾美耳球虫作为一种新型的模式生物，具有活疫苗载体的功能，通过改造镰形艾美耳球虫的致病基因，减轻对宿主肠道的损伤，使镰形艾美耳球虫成为一种新型抗原载体，用于进一步研究抗原与宿主免疫细胞之间的相互作用，具有更为广阔的应用前景。

【相关文献】[1] Tang X，Yin G，Qin M，et al. Transgenic Eimeria tenella as a vaccine vehicle：expressing TgSAG1 elicits protective immunity against Toxoplasma gondii infections in chickens and mice[J]. Sci Rep，2016，6：29379.[2] Clark J D，Oakes R D，Redhead K，et al. Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors：anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella- delivered CjaA[J]. Vaccine，2012，30（16）：2683-2688.[3] Huang X，Zou J，Xu H，et al. Transgenic Eimeria tenella expressing enhanced yellow fluorescent protein targeted to different cellular compartments stimulated dichotomic immune responses in chickens[J]. J Immunol，2011，187（7）：3595-3602.[4] Qin M，Tang X，Yin G，et al. Chicken IgY Fc expressed by Eimeria mitis enhances the immunogenicity of E. mitis[J].Parasit Vectors，2016，9：164.[5] Qin M，Liu X Y，Tang X M，et al. Transfection of Eimeria mitis with yellow fluorescent protein as reporter and the endogenous development of the transgenic parasite[J]. PLos One， 2014，9（12）：e114188.[6] Shi T，Tao G，Bao G，et al. Stable transfection of Eimeria intestinalis and investigation of its life cycle，reproduction and immunogenicity[J]. Front Microbiol，2016，7：807. [7] Schito M L，Barta J R，Chobotar B. Comparison of four murine Eimeria species in immunocompetent and immunodeficientmice[J]. J Parasitol，1996，82（2）：255-262.[8] Dawn Owen. Eimeria falciformis（Eimer，1870）in specific pathogen free and gnotobiotic mice[J]. Parasitology，1975，71：293-303.[9] Shirley M W，Ivens A，Gruber A，et al. The Eimeria genome projects：a sequence of events[J].Trends Parasitol，2004，20（5）：199-201.[10] Su H L，Liu X Y，Yan W C，et al. piggyBac transposon-mediated transgenesis in the apicomplexan parasite Eimeria tenella[J]. Plos one，2012，7（6）：e40075.[11] Kurth M，Entzeroth R. Reporter gene expression in cell culture stages and oocysts of Eimeria nieschulzi（Coccidia，Apicomplexa）[J]. Parasitology Research，2009，104（2）：303-310.[12] Suo X，Zhang J X，Li Z G，et al. The efficacy and economic benefits of Supercox，a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China[J]. Vet Parasitol，2006，142（1/2）：63-70.[13] Zhang L，Liu R，Ma L，et al.Eimeria tenella：expression profiling of toll-likereceptors and associated cytokines in the cecum of infected day-old and three-week old SPF chickens[J].Exp Parasitol，2012，130（4）：442-448.[14] Sumners L H，Miska K B，Jenkins M C，et al. Expression of toll-like receptors and antimicrobial peptides during Eimeria praecox infection in chickens[J]. Exp Parasitol，2011，127（3）：714-718.[15] Zhou Z，Wang Z，Cao L，et al. Upregulation of chicken TLR4，TLR15 and MyD88 in heterophils and monocyte- derived macrophages stimulated with Eimeria tenella invitro[J]. Exp Parasitol，2013，133（4）：427-433.。