早熟艾美耳球虫上海株的分离鉴定及生物学特性观察
3株鸡巨型艾美耳球虫抗原性分析
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Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2014 Vol. 46 No. 12
囊数和每日每只鸡排卵囊总量，统计每只鸡平均排卵 囊总量，以卵囊相对减少率 （ 保护率） 作为试验指 标。判断方法： 按 McDonald 等［5］报道的方法对保护 率进行评价，以保护率≥75% 判为有效。
畜牧与兽医 2014 年 第 46 卷 第 12 期
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3 株鸡巨型艾美耳球虫抗原性分析
吴彩艳，孙铭飞，戚南山，廖申权，李娟，吕敏娜，谢明权
（ 广东省农业科学院动物卫生研究所 / 广东省兽医公共卫生公共实验室 / 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640）
摘要： 本研究对 3 株鸡巨型艾美耳球虫 （ Eimeria maxima） 福建株、上海株和广东株进行免疫原性分析，其中广东株属于早熟株。将 7 日龄雏鸡
将 7 日龄雏鸡分成 3 组，每组 20 只，分别经口 免疫 E. maxima 福 建 株、上 海 株 和 广 东 株 孢 子 化 卵 囊，免疫剂量为 100 个 / 羽，同时设立不免疫不攻虫 对照组。12 d 后从免疫组挑选大小一致、体重相近 的鸡分成 9 组，每组 5 只，分别经口攻击上海株、广 东株和福建株孢子化卵囊，剂量为 100 个 / 羽，从攻 虫后第 4 天起，每日收集各组粪便，进行 OPG 记数， 至攻虫后第 11 天结束试验。将 12 日龄未免疫鸡分成 3 组，每组 5 只，分别经口感染上海株、广东株和福 建株孢子化卵囊，剂量为 100 个 / 羽，作为免疫攻虫 组对照 （ 表 1） 。用麦氏虫卵计数法计数 每 克 粪 便 卵
免疫攻虫组与不免疫攻虫组相比较，卵囊产量下 降明显，说明雏鸡免疫后对球虫的再感染具有一定的 抵抗力 （ 图 2） 。
鸡野外艾美耳混合球虫抗药性的测定
· ｌ２ ·
· 试验 观 察 ·
《上 海 畜牧 兽 医通讯 》 ２０１８年 第 ２期
表 ２ 各 试 验 组 病 变 记 分 及 ＲＬＳ值
重 抗 药 。 氯羟 吡啶是投放 市场多年 的老药 ，许多地 区有较
严重 的抗药性 ，基本 不用 或少 用 ，在上 海 地 区 曾有报
地 克 珠 利 在 大 规模 商 业 应 用 以 前 其 抗 球 虫 效 率 下 降与 卵囊 的 排 出、肠 道 病 变 一 起 出 现 时 ，即 可
果 良好 ［６］，随着 应用 时 间加 长及 用 药 程 序 的不 规 范 判 定球 虫 对 所 使 用 的 抗 球 虫 药 产 生 了 抗 药 性 。因
聚醚 离子 载体 类抗 球 虫 药 ，球 虫 可 能对 其产 生 交 叉
抗药 性 ，但不 能作 轻 易 判 断 ，除 非 确 知 一 种 抗 药 株
从未 接触 过 另 一 种 药 物 且 从 未 受 到 该 药 物 抗 药 株
表 ４ 各 试 验 组 抗 球 虫 指 数 （ＡＣＩ）
的 污 染 。 对 于现场 鸡球 虫 的抗药 性 ，不 同研 究 者 所采 用
接种 量 １０×１Ｏ 个 ／羽 。 １．６ 给 药
按推 荐 剂量 设计 浓 度 于卵囊 接 种 前 １ ｄ拌 料 给 药 ，连 续 ７ ｄ。 １．７ 剖 杀 、卵 囊收 集
给药 后 第 ８天所 有鸡 称 重 、剖杀 ，统 计盲 肠 和小 肠 的病 变 记分 ，收 集各 组 ５－８ ｄ的粪 便 卵 囊 ，混 匀 ， 计 数 混合 卵 囊 数 。具 体 肠 道 病 变 计 分 和 卵 囊 值 分 别 按 ＪＯＨＮＳＯＮ 和 ＲＥＩＤ［３］及 角 田清 方 法进 行 。 １．８ 抗 药 性 判 定 指 标
毒害艾美耳球虫早熟株与亲本株繁殖力的观察
毒害艾美耳球虫早熟株与亲本株繁殖力的观察李赟;古少鹏;赵剑【摘要】为选育毒害艾美耳球虫(E.necatri)早熟株,了解其繁殖力,为早熟弱毒活苗的研制奠定基础,本试验运用球虫的单卵囊分离技术得到一株E.necatrix(P0),并对其进行了早熟选育,得到了E.necatrix早熟株P8.P0和P8分别以0.05×104、0.1×104、0.5×104和1×104个/只的剂量接种11日龄雏鸡,接种后第7～13天每天检测粪便中的卵囊产量.结果表明,P0与P8均为接种0.5×104个/只的卵囊产量最大;P8的繁殖力是P0的55%;P8的卵囊高峰期较P0有提前趋势.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】4页(P151-154)【关键词】毒害艾美耳球虫;分离鉴定;早熟选育;繁殖力【作者】李赟;古少鹏;赵剑【作者单位】山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西省太原市家畜防疫检疫站,太原030027;山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S852.72+3鸡球虫病是造成现代养禽业经济损失最大的寄生虫病。
毒害艾美耳球虫(E.nacatrix)是9种球虫中致病力最强的虫种之一。
全球每年因球虫病造成的损失达80亿美元(A llen等,2002)。
当前,疫苗预防仍是防控球虫病的首选方法,而采用早熟选育法制备的球虫疫苗,因其具有致病力大大下降,免疫原性良好的特性,已被广泛应用于实践。
但同种球虫早熟选育后,其繁殖力与亲本株有何差异及差异大小,直接决定此早熟虫株是否适用于制备疫苗,或疫苗制备过程中虫株所需的数量及接种鸡体的最佳剂量。
因此,对同种球虫早熟株与亲本株的繁殖力进行研究,了解在早熟选育过程中,卵囊繁殖力的变化,对疫苗的制备具有极其重要的意义。
本试验通过观察E.nacatrix山西分离株的亲本株与早熟株繁殖力变化,为选育早熟疫苗所需的虫株及实验室研究E.nacatrix提供了理论依据,也为进一步开展鸡球虫病的损伤机理与免疫机制研究奠定了基础。
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mRNA表达的影响117、泌乳牛舍局部通风和待挤区冷风机使用效果的研究118、棉粕日粮对蛋鸡生产性能和肝脏脂肪代谢的影响及其机制研究119、免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究120、目前我国食品安全存在的主要问题及对策121、奶牛γ-干扰素基因的表达及其在乳房炎防治中的初步应用122、奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗构建及实验免疫123、奶牛酮病、脂肪肝糖异生和脂肪动员的神经内分泌调控机制124、奶牛酮病氧化应激致肝细胞凋亡的信号转导机制研究125、奶牛隐性乳房炎的诊断方法与细菌学研究126、内蒙古通辽地区奶牛布鲁氏菌病流行病学调查和感染机理初步分析127、内蒙古自治区手足口病主要病原分子生物学特征和人肠道病毒71型致病病理学研究128、黏膜免疫佐剂对鸡黏膜和系统免疫反应机理的研究129、牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒分子生物学检测技术研究130、牛粪垫料对泌乳牛趴卧行为和环境卫生的影响131、牛副流感病毒3型山东分离株致病性研究及荧光定量RT-PCR的建立132、牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植133、牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究134、牛羊仰口线虫PCR-RFLP鉴别方法的建立及线粒体全基因组序列分析135、牛主要呼吸道病毒病血清学调查、牛病毒性腹泻病毒分离株鉴定及疫苗研究136、普通牛FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的克隆、表达及其对肉质性状的遗传效应分析137、铅镉联合对大鼠肾脏的毒性研究138、禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性139、禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析140、禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究141、禽网状内皮组织增生病病毒与J-亚群白血病病毒的致病性及其疫苗研究142、犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究143、犬新孢子虫宿主细胞结合蛋白筛选及其免疫原性分析144、日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用145、日粮添加ω-3PUFA对绍鸭产蛋性能、脂质代谢及免疫功能的影响146、日粮硒对雏鸡免疫功能影响的机理研究147、柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子差异表达基因的研究148、肉鸡热应激损伤与热休克蛋白70表达的研究149、肉鸭Myostatin剪切体的表达和调控150、乳酸菌的分离鉴定及其抗菌肽与发酵性能研究151、乳酸菌及其培养液对肉鸡生产性能、肠道菌群及肠道结构的影响152、乳腺炎细胞因子及T淋巴细胞亚群研究153、瑞香素对小鼠淋巴细胞免疫抑制效果及其作用机制的研究154、三肽囊素对环磷酰胺免疫抑制的阻断机制研究155、上海市郊规模化养猪场锌的应用状况调查研究156、圣羽王鸽MSTN基因多态性及其与生长、肉质性状相关性研究157、石房蛤毒素及其抗体适配子的制备与检测方法的建立158、四种中药多糖增强免疫和抗病毒作用及机理研究159、太阳能热水工程在寒区规模化奶牛场应用效果的研究160、调控抗病毒天然免疫的miRNA筛选及其作用机制研究161、围产期健康奶牛与酮病、亚临床低钙血症病牛血液代谢谱的比较与分析162、围产期奶牛干物质摄入减少及脂肪动员的神经内分泌调控机制163、围产期奶牛瘤胃微生物区系的变化及微生态制剂的调控作用164、我国O型泛亚1系口蹄疫病毒表型差异的分子基础165、我国部分地区奶牛乳腺炎流行病学调查及IRAK2基因与乳腺炎相关性分析166、我国动物疫病区域化管理模式的应用与分析167、我国农场动物福利评价研究168、我国兽医体系效能评估指标研究169、硒蛋白W对鸡免疫机能的影响170、硒对奶牛乳腺炎抗炎作用和炎症信号转导通路调节机制的研究171、细胞自噬在新城疫病毒感染过程中的作用172、腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗的构建及评价173、小鼠肝损伤动物模型的建立及在束缚应激研究中的应用174、小鼠巨噬细胞TLR2、TLR4及RP105在金黄色葡萄球菌感染中的天然免疫应答机制175、小型猪特异性麻醉颉颃剂的研制及其催醒机理的研究176、新城疫病毒单感染及猪流感病毒与猪链球菌共感染差异蛋白组学分析177、新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究178、鸭坦布苏病毒分离鉴定及其生物学特性的研究179、鸭疫里氏杆菌免疫诊断方法及在感染鸭肝脏差异表达基因的研究180、芽孢杆菌制剂对大肠杆菌感染仔猪免疫应答及肠道菌群影响181、羊布鲁氏菌蛋白质组学分析及免疫候选抗原的筛选与鉴定182、羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究183、养殖环境真菌气溶胶及相关真菌毒素的检测184、一种复方中药提取工艺的优化及颗粒剂制备185、乙型脑炎病毒分子流行病学、诊断及重组疫苗研究186、异黄酮植物雌激素对动物生长及其吸收机理的研究187、益生菌制剂的研制及其对雏鸡免疫学影响和机理的研究188、益生乳酸杆菌的黏附及免疫调节作用研究189、益生乳酸杆菌的筛选及中草药协同作用的研究190、应用SSH技术筛选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因191、有机硒源在蛋鸡生产中的应用及其机理研究192、孕酮与干扰素-τ对体外培养的牛子宫内膜细胞基因组表达谱的影响193、植酸酶的提取、检测及其在肉鸡生产中的应用研究194、植物缩合单宁对大肠杆菌的抑制作用及抑菌机理的研究195、治疗鸡大肠杆菌病的中药方剂筛选及其作用机理研究196、治疗奶牛乳房炎的复方中药制剂的开发研究197、治疗奶牛乳房炎蒙药复方的筛选及其抗炎免疫机理的研究198、致死型埃博拉病毒核酸和抗体检测方法的建立199、中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究200、中国部分地区猪流感病毒的分子流行病学研究201、中国养猪业生产波动分析与预测预警研究202、中国猪瘟流行病学现状与防制研究203、中药方剂香芪汤对RAW264.7巨噬细胞炎症信号通路的调节机制研究204、中药组方治疗奶牛子宫内膜炎的研究205、肿瘤细胞靶向抗菌肽嵌合体的设计及其抗肿瘤活性机制研究206、重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IF 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鹅艾美耳球虫(Eimeria anseris)克隆株的建立及生物学特性研究
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建 立 及 生 物 学 特 性 研 究
王 留，彭金彪 ，陶建平
Ａｂｓｒ ｃ ： Ａ ｌｎ ｔａｎ ｏ ｍｅｉ ｎｅｉ ｗ ｓｄ ｖ ｌｐ ｄ ｈ ｃ ｓｓｗ ｒ ｈ ｐ ｄ ｌ ｅ ａｓ ｈ ｒ ｕｍｏ ｎｅ ｙ ａｔｕ ｃｔ ｏ ｅ ｗ ｔ ｔａ ｔ ｃｏ ｅｓｒｉ ｆＥｉ ｒ ａ ｓｒ ａ ｅ ｅｏ ｅ ．Ｔ ｅｏ ｙｔ ｅｅｓ ａ ｅ ｉ ｐ ｅｅｓ ｒ ｕ ｔｄ ｂ ｒｎ ａｅ ｃ ｎ ｉｈ ａ ａ ｓ株 ；建立 ；生物学 特性
中图分类号 ：Ｓ ５ ．３ ． ８ ８ ３ ５９
文献标识码 ：Ａ
文章编 号：０２ －１０ ２ ０ ）３ ０２ —３ ５ ９５ ３ （０ ６ ０ —０ ００
Ｄｅ ｅ ｏ ｍ ｅ ｔ ａ ｄ ｏ ｏ ｉ ａ ｈａ ａ ｔ ｒ ｚ ｔｏ ｓ ｏ ｌ ｎｅ ｓ ｒ ｉ ｆＥｉ ｅ ｉ ｎ ｅ ｉ ｖ ｌｐ ｎ ｎ ｂｉ ｌ ｇ ｃ ｌｃ ｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｆ ａ ｃ ｏ ｔ ａ ｎ ｏ ｍ ｒａ ａ ｓ ｒｓ
贡兰影．有 机分析 实验 教程 ［ ．上 海 ：华 东师 范大学 出版 Ｍ］
Ｗ ＡＮＧ Ｌｕ， Ｐ ＮＧ Ｊｎ ｂａ ， Ｔ ｉｎ ｐｎ ｉ Ｅ ｉ —ｉｏ ＡＯ Ｊａ —ｉ ｇ
巨型艾美耳球虫早熟株选育及其相关生物学特性研究
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株 选 育 方法 ， 实验 室保 存 的 Ｅ ｍ ｘ ａ进 行 了早 熟 株 选 育 ， 比 较 了所 获 得 的 早 熟 株 与母 株 在 卵 囊 大 小 、 对 ａｉ ｍ 并 繁 殖能力、 致病 性 、 疫保 护 力 等 生 物 学 特 性 上 的 差 异 。经 过 １ 免 ７代 早 熟 株 选 育 ， ． ａｉ ａ的 潜 在 期在 同等 剂 量之 下 ， 熟株 的 致病 性 低 于母 株 ， 免 疫 保 护 力 和 免 疫 原 性 与 母 株 相 当。 早 熟 早 但
株 的选 育 成 功 ， 为球 虫早 熟株 弱 毒 疫 苗 的研 制 以及早 熟株 相 关 基 因的 筛选 提 供 了重要 材料 。 关 键 词 ： 虫 ；巨型 艾 美耳球 虫 ； 熟株 ； 育 ； 性 球 早 选 特
中 图分 类 号 ： ８２ ７３ Ｑ１ ￥５ ．２ ： 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：６４— ４２ ２ １ ）５— ０ ２— ７ １７ ６２ （０ ０ ０ ０４ ０
Ｓ ＥＬＥＣＴＩ ｏＮ ＡＮＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩ ＴＩ Ｓ ＣＳ ｏＦ ＰＲＥＣｏＣＩ Ａ ｏＵＳ １ ｜ Ｏ ＥＩ ＥＲｉ Ｍ Ａｘｌ Ａ Ｍ Ａ Ｍ
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堆形艾美耳球虫早熟株生物学特性及其抑制消减cDNA文库的构建的开题报告
堆形艾美耳球虫早熟株生物学特性及其抑制消减cDNA文库的构建的开题报告该开题报告的主要内容是关于堆形艾美耳球虫早熟株生物学特性及其抑制消减cDNA文库的构建的研究计划。
1. 研究背景及意义堆形艾美耳球虫是一种常见的土壤寄生线虫，常常会引起植物根部的病害。
其寄生生活史具有显著的物种特异性和适应性。
目前，针对线虫的防治方法主要是化学控制和土地轮作等传统方法，但这些方法的应用存在着一系列的限制和不足，例如副作用大、易产生抗药性等等。
因此，寻求新的、高效的线虫防治方法就变得至关重要。
2. 研究目的本研究旨在探究堆形艾美耳球虫早熟株生物学特性，揭示其生命周期、生殖特征等方面的规律，同时以抑制、消减种群为出发点，构建cDNA文库并筛选相关的基因，在基因水平上探讨防治新方法。
3. 研究方法（1）线虫生物学特性的研究：通过定期观察、计数和微环境模拟等方式，探究堆形艾美耳球虫早熟株的生命周期、生殖特性等方面的生物学特性。
（2）构建cDNA文库：使用高通量测序技术构建抑制、消减堆形艾美耳球虫早熟株种群的cDNA文库。
（3）生物信息学分析：对cDNA文库数据进行序列比对、拼接、注释以及基因表达谱分析等方法，筛选与抑制消减相关的差异表达基因并进行注释。
（4）基因功能实验：通过基因克隆、表达、敲除等方法，验证差异表达基因在防治堆形艾美耳球虫中的作用机制。
4. 研究意义及预期结果本研究将揭示堆形艾美耳球虫早熟株的生物学特性和生殖行为，为防治堆形艾美耳球虫提供新的理论基础；同时构建的cDNA文库和基因水平上的研究将有助于发现具有防治作用的新型靶标，为无害、低毒的线虫防治提供新的思路和方法。
预期结果包括：发现新型抑制消减堆形艾美耳球虫的基因、深入探究其功能机制，为农业生产中的线虫防治提供新的思路和技术支持。
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早熟艾美耳球虫上海株的分离鉴定及生物学特性观察陈兆国;米荣升;于慧珠;郝言明;胡义彬;黄燕;李正锋;李艳;林矫矫【摘要】为分离和鉴定早熟艾美尔球虫(Eimeria praecox),观察其主要生物学特性,本研究采用单卵囊感染技术分离单一虫株,通过卵囊形态学、PCR技术和18S rRNA基因检测,对其进行性状观察、虫种鉴定和系统发生关系分析.在获得的5株单一虫株中,对其中一株的卵囊形态、寄生部位、最短孢子化时间和最短潜在期进行观察.结果表明:该株球虫具有E.praecox的主要生物学特征;分离自肠道的卵囊明显小于分离自粪便的卵囊;最短潜在期为81 h;经PCR鉴定为E.praecox,命名为E.praecox上海株.测序结果显示,其18S rRNA基因序列长1 747 bp,与GenBank 登录的相关基因序列同源性为99.4%;该虫株对雏鸡呈轻度致病性.该虫株的分离和鉴定为丰富我国鸡球虫虫种资源,开展球虫病防治研究提供了依据.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)007【总页数】5页(P529-533)【关键词】早熟艾美尔球虫;分离;鉴定;生物学性状;18S rRNA基因【作者】陈兆国;米荣升;于慧珠;郝言明;胡义彬;黄燕;李正锋;李艳;林矫矫【作者单位】中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241;中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室/上海动物生物技术研究中心,上海,200241【正文语种】中文【中图分类】S852.72鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫引起的一种寄生虫病，严重危害鸡的生长发育，对雏鸡的危害尤为严重。
鸡球虫分为：堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)和柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)7种。
其中E.praecox是一种“早熟型”球虫，卵囊相对较大，最短孢子化时间为12 h，最短潜在期为83 h。
由于该虫种对鸡的致病性较弱，因而对其研究较少。
由于鸡球虫病多为球虫混合感染引起，并且感染率高，对养鸡业造成的损失巨大，因此愈来愈受到人们的关注。
本研究对上海田间球虫混合样品进行分离和鉴定，为丰富我国鸡球虫虫种资源，发展球虫病防治技术奠定基础。
1 材料和方法1.1 球虫样品和实验动物含E.praecox卵囊的多个艾美耳球虫虫种，分离自上海郊区某鸡场，经鸡传代后收集卵囊，孢子化后4℃保存备用；黄羽肉鸡购自上海郊区某大型鸡场。
1.2 菌株和载体 E.coliDH5α由本实验室保存；pMD18-T载体购自TaKaRa公司。
1.3 主要试剂 TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、ExTaq 酶、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司；100 bp DNA Ladder购自北京天根生化科技有限公司。
1.4 引物设计根据Schnitzler等报道设计鸡球虫虫种鉴定引物[4-5](表1)。
根据Barta等报道设计鸡球虫18S rRNA鉴定引物[6]，上游引物ERIB1：5'-ACC TGGTTGATCCTGCCAG-3'，下游引物ERIB10：5'-C TTCCGCAGGTTCACCTACGG-3'。
由上海桑尼生物技术有限公司合成。
表1 鸡球虫虫种鉴定引物Table 1 Primers used forEimeriaspecies identification虫种Species E.tenella引物名称Primer names ETF ETR ENF ENR EMaF EMaR EAF EAR EPF EPR EMiF EMiR EBF EBR引物序列(5'-3')Primer sequences(5'-3')AATTTAGTCCATCGCAACCCT CGAGCGCTCTGCATACGACA TACATCCCAATCTTTGAATCG GGCATACTAGCTTCGAGCAAC GTGGGACTGTGGTGATGGGG ACCAGCATGCGCTCACAACCC GGCTTGGATGATGTTTGCTG CGAACGCAATAACACACGCT CATCATCGGAATGGCTTTTTGA AATAAATAGCGCAAAATTAAGCA TATTTCCTGTCGTCGTCTCGC GTATGCAAGAGAGAATCGGGA GATCAGTTTGAGCAAACCTTCG TGGTCTTCCGTACGTCGGAT扩增片段大小(bp)Size of fragments(bp)278E.necatrix 383 E.maxima 220 E.acervulina 321 E.praecox 390 E.mitis 350E.brunetti 3111.5 E.preacox单一虫株的分离1.5.1 预分离收集、纯化球虫样品，经嗉囊感染14日龄黄羽肉鸡10羽，每羽感染5×104个孢子化卵囊。
感染后80 h～92 h收集粪便，按常规方法收集卵囊，加入2.5%重铬酸钾水溶液，培养至孢子化卵囊达80%以上，4℃保存备用。
1.5.2 单卵囊分离按文献[7]方法感染单卵囊，共感染雏鸡15羽。
感染后5 d(DPI)开始逐只检查鸡粪中是否含有球虫卵囊，7DPI剖杀阳性鸡，取小肠前1/3部分内容物镜下观察，收集卵囊，28℃培养至孢子化。
1.6 生物学性状检测取1.5.2培养的孢子化卵囊，感染无球虫雏鸡，从感染后76 h起，每小时收集粪便并检查是否有卵囊排出，至发现卵囊止；7DPI剖杀，检查肠道卵囊寄生部位；收集肠道卵囊进行孢子化培养，观察最短孢子化时间；观察孢子化和未孢子化卵囊的形态。
1.7 单一虫株的虫种鉴定1.7.1 虫种的初步确定根据卵囊形态大小、最短潜在期、寄生部位和最短孢子化时间等结果，参考文献，初步确定虫种。
1.7.2 虫种PCR鉴定取105个经饱和盐水漂浮法纯化的孢子化卵囊，匀浆破碎，按TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书操作提取虫体基因组DNA。
以基因组DNA为模板，用表1中7对引物分别进行PCR 扩增。
反应条件：95℃2 min；95℃30 s、62℃30 s、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。
1.8 18S rRNA基因的扩增和序列测定1.8.1 PCR扩增以基因组DNA为模板，应用18S rRNA引物进行PCR扩增。
反应条件：94℃5min；94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min。
产物经琼脂糖凝胶电泳观察。
1.8.2 扩增片段的克隆及筛选应用V-gene DNA凝胶回收试剂盒对扩增片段进行回收并纯化，与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞DH5α中，采用蓝白斑筛选阳性菌落，提取重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定，筛选阳性克隆。
1.8.3 序列测定和分析阳性重组质粒由上海英骏生物技术有限公司测序。
利用DNAStar及Mega 4.0软件进行序列比对和分析，构建系统发生树。
1.9 单一虫株的致病性观察选取1个单一虫株进行致病性试验。
将体质量相近的14日龄雏鸡60羽，平均分为 6组，经嗉囊接种 0、1×104、5×104、1×105、2×105、4×105个孢子化卵囊。
7DPI称重、剖杀，观察各组实验鸡的增重、饲料转化率和肠道病变。
1.10 数据处理采用SPSS 12.0进行数据的统计和显著性分析。
2 结果2.1 单卵囊分离结果对粪便和小肠内容物进行检查，单卵囊接种的15羽雏鸡中，有5羽感染，单卵囊接种感染率为33.3%。
收集编号为EPSH的单一虫株的卵囊进行重新接种、虫种鉴定和生物学性状测定。
2.2 EPSH的生物学性状测定2.2.1 卵囊形态卵囊多数呈椭圆形，少数呈卵圆形或球形，壁光滑，无卵膜孔；经孢子化的卵囊内有一极粒，无卵囊残体，无孢子囊残体。
随机测定从肠道、粪便收集的未孢子化和孢子化卵囊各 50个，大小为 15.00μm～25.00 μm×13.75 μm～22.5 μm，平均大小为20.07 μm×17.52 μm，形状指数(shape index，SI)为1.15，具体见表2。
表2 ETSH株球虫卵囊大小Table 2 Oocysts size of ETSHa,b,c andd:difference in significance analysis肠道Intestine粪便Feces未孢子化卵囊Unsporulated oocysts孢子化卵囊Sporulated oocysts未孢子化卵囊Unsporulated oocysts孢子化卵囊Sporulated oocysts 15.00～22.50 16.25～22.50 17.50～25.00 17.50～25.00 18.57±1.77a 19.14±1.66ab 20.77±2.16c21.64±1.77d 13.75～18.75 13.75～22.50 15.00～21.25 15.75～22.0015.91±1.11a 16.41±1.54ab 18.33±1.36c 19.29±1.34d 1.17 1.17 1.13 1.12最小显著差数法(Least-significant difference，LSD)检验分析显示，收集于肠道的EPSH株孢子化卵囊与未孢子化卵囊长和宽的显著性(Sig)分别为0.137和0.071，p>0.05，无显著差异；但收集于肠道的卵囊与收集于粪便的卵囊比较，Sig均为0，p<0.01，差异极显著；收集于粪便的未孢子化卵囊分别与孢子化卵囊的长和宽比较，其中长度的Sig为0.020，p<0.05，差异显著；宽度的Sig为0，p<0.01，差异极显著(表 2)。