分子克隆方法之同源克隆方法
分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
单片段克隆 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
突变 缺失 插入
从头合成质粒 之 单片段克隆
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段 PCR产物纯化
已有质粒改造 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒
转化
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
第22页，共46页。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
第10页，共46页。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
第八章知识资料知识资料基因克隆
Word-可编辑第八章基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组ＤＮＡ技术，是应用酶学主意，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、衔接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中举行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
克隆（clone）一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程(cloning)。
一个残破的基因克隆过程包括以下步骤：１、获得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因与载体在体外衔接；３、重组DNA分子导入宿主细胞；４、筛选、鉴定阳性重组子；５、重组子的扩增与／或表达。
第一节重组DNA中常用的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA衔接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，一、限制性内切酶的定义、命名和分类限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和Sau3A。
千里之行，始于足下三、其它工具酶参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）第二节载体－宿主系统一、概述载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞举行扩增和表达的DNA,它们普通是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：１、能在适当的宿主细胞中复制；２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
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PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O
Up to 10 μl
5×CE II Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物
2 μl 25～100 ng 10～100 ng
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
✓ 单片段克隆 ✓ 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
✓ 突变 ✓ 缺失 ✓ 插入
.
从头合成质粒 之
单片段克隆
.
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段
5’
质粒同源序列
PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段
5’
.
3’
3’
5’
PCR产物纯化
目的载体线性 化（PCR或酶 切）及纯化
5’ 3’
3’ 5’
单片段克隆原理图二
+
线性化载体
3’--->5’外切酶活性
同源反应示意图
3’ 5’
5’ 3’
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后. PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
3’ 5’ 5’ 3’
+
3’ 5’
突变位点设计在同源序列内
3’ 5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL
Primer 1
1μL
用包含同源序列的引物做PCR 扩增出含同源序列的片段1
片段1 PCR产物 纯化
片段2
+ PCR产物
纯化
片段3
+ PCR产物
纯化
+… +
目的载体线性化 （PCR或酶切） 及纯化
同源反应
目的质粒
.
转化
多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多
引物设计
5’ 3’
3’ 5’
5’ 多个片段PCR 3’ 及其产物纯化
6μl
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
.
从头合成质粒 之
多片段克隆
.
多片段克隆流程图
从cDNA PCR获取包含目的片段1 含目的片段1的质粒
.
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多片段克隆同源反应体系（标准版）
ddH2O 5×CE MultiS Buffer 线性化克隆载体
插入片段扩增产物1 插入片段扩增产物2 插入片段扩增产物3 …… Exnase® MultiS Total
Up to 10 μl 2 μl
[0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol)
已有质粒改造 之
突变
.
质粒突变流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化 同源反应 目的质粒 转化
.
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线. 性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
Primer 2
1μL
ddH2O
22.5μL
Template
0.5μL
Total
50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
PCR仪设置
98℃
10s
55℃
5s 30-35Cycles
72℃
30s/kb
72℃
30s/kb
12℃
+∞
*扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
1 μl 10μl
.
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
目的载体线 性化பைடு நூலகம்PCR 或酶切）及 纯化
3’ 5’ 5’ 3’
+
突变位点设计在同源序列内
3’
5’
5’
3’
3’
5’
线性化载体
同源反应
目的质粒
.
多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变
引物设计
5’
3’
5’ 多个片段PCR 3’
及其产物纯化
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化
Exnase® II
1 μl
Total
10μl
同源反应体系(简便版)
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
5×CE II Buffer
2 μl
线性化克隆载体
1μl
插入片段扩增产物
PCR产物纯化
+
目的载体线性化（PCR 或酶切）及纯化
同源反应 目的质粒 . 转化
单片段克隆原理图一
cDNA
5’
CDS区域
AAA… 3’
PCR获取包含目的基因CDS序列的片段
与基因互补序列 （18-27bp）
5’
正向引物(实线) 3’
目的基因片段
质粒同源序列 （15-20bp）
目的基因片段 质粒
3’ 反向引物(实线)