彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。
我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？
1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和
细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
的，我怕脱胶，是把玻片放在搪瓷盘中水平裂解、中和的。听说有人是放在染色缸里垂直的都不会脱胶，我真愁死了，请教大侠载玻片规格磨砂程度，在哪里买的，盖玻片规格呢？裂解、电泳、中和的细节问题能否给点指导呢？能够得到您的帮助将非常感谢！
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指
有关中性单细胞凝胶电泳的总结要点
1、辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件； 旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。 低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。 凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。 注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。 2、中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例） 1) 淋巴细胞的提取 ①取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。 ②取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。 ③重复洗涤细胞两次。 2) 琼脂糖玻片的制备 ①制好微型电泳槽。 ②使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。 3) 细胞裂解、电泳 ①好的玻片浸入新配的预冷的(4oC)中性裂解液中裂解1.5h。 ②取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。 ③将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。 4) 染色 用溴化乙啶(2μg/ml)染色。 用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。 5)读片和分析 ①用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓 取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。 ②用CASP软件分析系统分析慧星图像。 3、biomed96 ：lq6688你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。 铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。 裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解1小时 解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。 染色：PI 50ug/ml染色15分钟。 结果是什么都看不到，好像一点都没染色。 lq6688：首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解
彗星实验
应用慧星试验研究细胞D NA损伤的原理与方法 山西大学生命科学系环境生物毒理学研究室(太原030006) 孟紫强 中国辐射防护研究院二所 张连珍 提 要 对应用慧星试验(即单细胞微凝胶电泳(SCGE技术)研究细胞DNA损伤的操作过程、技术原理以及实验操作过程中应注意的事项,进行了详细介绍和讨论。 关键词 慧星试验 单细胞微凝脉电泳 DNA损伤 哺乳类细胞 淋巴细胞 诱变剂往往是通过引起DNA损伤而诱发细胞突变和癌变。近年来由Singh等改进和建立的慧星试验(Com et assay)即单细胞微凝胶电泳(SCGE)技术,是一项测定和研究细胞DNA损伤的新技术,该技术在国外有关研究领域内已得到广泛的应用〔1,2〕。但在我国有关研究报道甚少。为此,本文对我们研究室建立和改进的SCGE技术作了详细报道,以期与国内同行交流和进一步改进。 1 SCGE测定原理 哺乳类细胞和人血淋巴细胞,其DNA的分子量很高且具有严密的超螺旋结构。在理想的实验条件下,对淋巴细胞的分离、处埋、裂解、碱处理等过程均保持在避光条件下小心谨慎地操作,使细胞DNA不受损伤,其DNA结构仍象在活细胞中那样完整,外加电泳电场就不会使DNA在凝胶中泳动。因此,在理想条件下,正常对照组细胞DNA在电泳之后仍应保持在原来位置。在SCGE实验中,细胞DNA之所以从原位向电泳电场的阳极迁移,形成慧星状图象,其原因是:当细胞DNA受损伤产生链断裂时,DNA的超螺旋结构受到破坏;在细胞裂解液作用下,细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中,而核DNA分子量很高不能进入凝胶,只能留在原位。在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片断从严密的超螺旋结构中释放出来;由于这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链,所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动,形成慧星状图象。DNA受损伤愈严重,产生的断链和碱易变性片断就愈多,断链也愈小;在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多,迁移的距离就愈长。因此,通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度,确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系。 我们的实验也表明,未处理的对照组淋巴细胞DNA在SCGE实验中也表现有微弱的迁移现象。我们认为这主要是由于人血淋巴细胞从静脉血分离出来之后,体外条件必竟是一种非生理条件,离开活体的细胞不可避免地会受到某些非生理条件的不利影响,使细胞中的DNA受到不同程度的损伤,导致微量DNA在电泳中迁移。我们在用碱洗脱法和DNA碱解旋速率法测定DNA单链断裂时,也发现未处理对照组的人血淋巴细胞和其它哺乳类细胞的DNA单链断裂占总DNA的5～30%〔3—5〕,也表明非生理条件能诱发DNA 损伤,与本实验结果一致。 2 SCGE实验方法 211 细胞分离和处理 (1)人血淋巴细胞分离:从健康人静脉采血015～1mL,沿离心管管壁滴加在等体积淋巴细胞分离液液面上,3500r m in离心2m in,吸取中间层淋巴细胞於10m l离心管中,加磷酸盐缓冲液(PBS)至5m l,1500r m in离心8m in,如此重复洗涤细胞两次,再将细胞悬于PBS,置4℃待用。(2)其它细胞的分离制备:对于体外培养的细胞株,若为贴壁生长的细胞,当细胞处于对数生长期时,可弃去培养液,加适量011%胰蛋白酶H ank’s溶液,在37℃下3-5m in,使细胞脱离瓶壁,用PBS洗涤细胞2—3次,调节至适当的细胞密度即可;若为悬浮培养的细胞,只需用PBS 洗涤细胞两次即可。对于实体肿瘤、胸腺、脾及其它组织,可用不锈钢剪去除结缔组织,剪碎,压研通过60目不锈钢网,再用PBS洗涤细胞2—3次,调节适当细胞密度即可。对于肝细胞的分离制备比较复杂,需经过含胶原酶和透明质酸酶的缓冲液进行器官灌注,再分离肝细胞。(3)紫外线或Χ-线照射:取新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞悬液,用PBS调细胞浓度为1×105个细胞 m l,于冰水浴中经紫加线或60Co-Χ线照射,照后细胞置于冰水浴中,并立即用于SCGE测定。(4)化学处理:新鲜分离的淋巴细胞或其它细胞,在SCGE测定前用待测化学物在37℃下处理2-4h,细胞密度均为1×105个 m l。随后将细胞保存在4℃下或冰水浴中,立即进行测定。 212 制片 (1)磨砂载玻片:用水砂纸(粒度,N o. 380)将普通光学显微镜用的载玻片(厚度较薄为宜)单面加水轻磨,使形成的磨砂面均匀细密。磨时谨防加压过大、用力过猛,以免在载玻片面上形成粗纹痕迹。实验发现如磨砂面有粗纹划痕,细胞裂解液处理后,载玻
彗星试验步骤
彗星试验步骤 1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。 1.5.4.1 制片 将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。 1.5.4.2 铺胶 取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。 1.5.4.3 裂解 轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。 1.5.4.4 解旋 从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。 1.5.4.5 电泳 电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。 1.5.4.6 漂洗及染色 电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。 以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。 1.5.4.7 结果观察 荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1 陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪 广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021） E-mail：lcling78@https://www.360docs.net/doc/772804304.html, 摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。 关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤 目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。 DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。 1. 材料与方法 1.1 试剂 MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级 1.2 皮层神经元的原代培养 制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心5 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验 一、实验器材 1.菌株 明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum） 2.培养基 酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。 3.溶液、试剂及待测物质 酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。 4.仪器及其他用品 生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。 二、目的要求 1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。 2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。 三、基本原理 发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下： FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光 具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为 407-409 nm处的蓝绿光。 发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法
ISS N 100727626 C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2005年10月 21(5):691～694 ?技术与方法? 双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法 翁 瑜1),2), 曾群力2),3), 姜 槐2), 许正平2),3)3 (1)浙江大学生命科学学院;2)浙江大学医学院浙江省生物电磁学重点研究实验室;3)浙江大学医学院环境基因组学研究中心,杭州 310031) 摘要 组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(22DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF27蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF27细胞总蛋白的提取效率.MCF27细胞经培养后,分别采用M2PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF27细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M2PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15～70kD,pH417～613的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M2PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF27细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容. 关键词 蛋白质提取,双向凝胶电泳,MCF27,条件优化 中图分类号 Q503 Comparison of Three Protein Extraction Methods by Tw o2 Dimensional E lectrophoresis WE NG Y u1),2),ZE NG Qun2Li2),3),J I ANG Huai2),X U Zheng2Ping2),3)3 (1)College o f Life Sciences,2)Bioelectromagnetics Laboratory,3)Research Center for Environmental G enomics, Zhejiang Univer sity School o f Medicine,Hangzhou 310031,China) Abstract Protein extraction from tissue or cells is a key step to achieve high2res olution protein separation in tw o dimensional electrophoresis(22DE).Three routine cellular total protein extraction methods were com pared in order to determine an optimal one for human breast cancer cell line MCF27.The cultured MCF27cells were lysed by M2PER kit,standard lysis buffer or im proved lysis buffer,respectively.Then the extracted total proteins were subjected to22DE,and the best extraction method was determined by the indexes of protein distribution and abundance on corresponding silver2stained gel.Data showed that use of M2PER kit gave the lowest res olution,in which m ost proteins were distributed in the pI ranging from417to613with m olecular weight between15kD and70kD.Standard lysis bu ffer im proved protein res olution with broader protein distribution pattern.Im proved lysis bu ffer generated the best res olution am ong these three methods,especially for the high2abundance and high m olecular weight proteins.Based on above results,we concluded that the im proved lysis bu ffer has the best protein s olubilization ability,which renders it much m ore suitable for cellular protein extraction from MCF27,and is m ore com patible with the conditions of22DE. K ey w ords protein extraction,tw o dimensional electrophoresis,MCF27,optimization 收稿日期:2004212203,接收日期:2005203221 国家自然科学基金项目(N o.50137030,30170792),浙江省自然科学基金项目(N o.301524)和浙江省卫生厅重点项目(N o.2004Z D006)资助 3联系人 T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/772804304.html, Received:December3,2004;Accepted:M arch21,2005 Supported by National Natural Science F oundation of China(N o.50137030,30170792),and Natural Science F oundation of Zhejiang Province(N o.301524),and K ey Program of Health Bureau of Zhejiang Province(N o.2004Z D006) 3C orresponding author T el:0571287217386,Fax:0571287217410,E2mail:zpxu@https://www.360docs.net/doc/772804304.html,
彗星实验要点
1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮， 用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。 2、 解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道 您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时 3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了 4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看 https://www.360docs.net/doc/772804304.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0 5、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单 6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。 其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好 7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影 响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。 结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。 8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，
彗星电泳方法整理
Comet assay简介 单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。 是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。 SCGE技术的原理： 细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。 随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。 依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。因此，研究人员渴望开发出一种专
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用
陕西师范大学 硕士学位论文 单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 姓名：罗明志 申请学位级别：硕士 专业：动物学 指导教师：齐浩 20050501
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用 罗明志 摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。 我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。 为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。 我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。 我们用单细胞凝胶电泳方法对磁场和抗癌药物对人自血病细胞Ｋ５６２以及小鼠原代肝细胞的ＤＮＡ损伤进行了检测。结果发现，Ｋ５６２细胞在９ｍＴ稳恒磁场中处理１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，这一损伤随处理时间的延长而增加，具有时间依赖效应；同样条件下对原代肝细胞的处理以及更长时间的处理（３６ｈ、４８ｈ、７２ｈ）均未发现细胞的ＤＮＡ损伤。在使用较低浓度紫杉醇（５０ｎｇ／ｍＬ）处理Ｋ５６２细胞１２ｈ后，即可导致细胞ＤＮＡ损伤，并表现出时间依赖效应，而仅在高浓度长时阳Ｊ的紫杉醇（８００ｎｇ／ｍＬ，２４ｈ）处理下才会引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。８００９９／ｍＬ环磷酰胺处理Ｋ５６２细胞１２ｈ即可引起细胞的ＤＮＡ损伤，而在１２００９９／ｍＬ时方才引起肝细胞的ＤＮＡ损伤。 关键词：单细胞凝胶电泳；ＤＮＡ损伤：ＵＶ；细胞培养；磁场；抗癌药物
药物毒理学考试要点
名词解释 1.血脑屏障：是指血液-脑组织间液和血液-脑脊液间的屏障，由血液-脑屏障、脑脊液-脑屏 障和血液-脑脊液屏障三个屏障构成。 2.内分泌系统：是一种整合性的调节机制，通过分泌特殊的化学物质来实现对有机体的控 制与调节。 3.药物依赖性：也称药物成瘾性，是精神活性物质与机体长期相互作用下造成的一种精神 状态（有时也包括身体状态），表现为强制性地连续不断地使用该药物的行为和其他反应，目的是去感受该药物所产生欣快性精神效应，或是为了避免由于停用该药物引发的戒断症状所带来的严重不适感。 4.直接致癌物：指进入机体后不需经代谢活化，直接与细胞生物大分子（DNA、RNA、蛋 白质）作用而诱发细胞癌变的化学物质。 5.间接致癌物：指进入机体后需经细胞内微粒体混合功能氧化酶系统等代谢活化后才具有 致癌性的化学物质。 6.促癌物：此类物质本身并无致癌性，严格的说不属于致癌物，但它可以与致癌物协同作 用，诱发突变细胞克隆扩增，促进癌的发生；或在致癌物作用之后，反复作用与细胞，加速癌细胞发展成为癌瘤。 7.促癌剂：具有促癌作用的物质，通过促进突变细胞的克隆扩增而发挥致癌作用。 8.前致癌物：未经代谢活化的间接致癌物称为前致癌物或原致癌物。 9.辅致癌物：有些化学物质既非引发剂，也非促长剂，本身并不致癌，但能增强引发剂和 促长剂的作用，即能加速致癌作用的过程。 10.药物的暴露：通过对暴露、时间依赖性的靶器官剂量与毒性作用关系研究解释毒性作用
机制。 11.急性毒性试验：又称单次给药毒性试验，系研究实验动物一次或24小时内多次给予受 试物后一定时间内所产生的毒性反应，观察期至少为14天。 最大耐受剂量（浓度）：（MTD）指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。 最小致死剂量（浓度）：（MLD）引起个别受试动物出现死亡的剂量 LD50：（半数致死量）预期引起50%动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。 12.长期毒性实验：又称重复给药毒性试验，是研究实验动物重复给予较大剂量的受试物后 产生的毒性反应特征，药物非临床安全性评价的重要内容。 13.一般生殖毒性实验：在雌雄动物交配前的交配期直至胚胎着床给药，评价受试药物对动 物生殖的毒性干扰作用，即生殖过程的第一阶段试验。 14.致畸敏感期毒性试验：妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合阶段给药，评价受试药物对妊娠 动物、胚胎及胎仔发育的影响。致畸敏感期毒性试验即生殖过程的第二阶段试验。15.围生期毒性试验：从胚胎着床到幼仔断奶这段时期给药，检测受试药物对妊娠及哺乳动 物、胚胎发育以及子代出生后生长发育的不良影响。围生期毒性试验即生殖过程的第三阶段试验 16.光敏反应：指皮肤对光线敏感产生的不良反应，是由某些药物（化学药物）与皮肤接触、 经特定波长的光照后引起的皮肤损伤。 17.靶点：医学上进行某些放射治疗时，放射线从不同方位照射，汇集病变部位，这个病变 部位叫做靶点。 18.靶部位：药物吸收进入机体分布于全身，通常仅对其中某些部位造成损害，被药物造成 损害的部位叫靶部位。
凝胶电泳实验报告模板
凝胶电泳实验报告模板
降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？ 1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和 细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
彗星实验
彗星实验 彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。 实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA 量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。 实验材料： 玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。 实验步骤： 1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻 片滑面及四周吸干，自然晾干备用； 2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5 细胞/ml悬浮细胞；
3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察 细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min； 4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min; 5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上 的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min; 6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。 7.漂洗及染色：电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2次，每次15min,以中和强碱。滴加 DAPI染色，立即置于荧光显微镜下观察。 结果观察： 荧光显微镜下20倍波长，激发波长377nm，发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=（拖尾细胞数/50）*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（TL）=全长-头长，计算各剂量组的平均尾长。
凝胶电泳实验原理与步骤
一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染