彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
单细胞电泳凝胶片的保存方法
４ ） 读片 ： 低温 保存 的凝 胶 片 分 别 于第 １ ， ２ ， ３ ， ４和 片 随机 选取 ５ Ｏ个 细胞 ， 使 用 国 产 单 细 胞 凝 胶 电泳 分
析软件 Ｉ ＭＩ １ ４ １ １ ＿ ３ Ｊ ， 把尾长、 Ｏ ｌ ｉ ｖ ｅ尾 矩 、 尾 Ｄ Ｎ Ａ、 尾／
１ ． ２ 实 验 方 法
静脉 血 ５ ｍＬ ， 取 自健康 ４ ｏ岁女性 ， 肝 素抗 凝 。正
１ ） Ｈ Ｏ 处理 ： 常规 提取 淋 巴细胞 于 ３ ｍ Ｌ Ｐ Ｂ Ｓ中 后 均分 到 ３个试 管 中 ， 每管分别加入 Ｈ Ｏ 至终 浓 度
２ 结果和 讨论
光２ ０ ｍ ｉ ｎ 。在 电压 １ ． ２ ５ Ｖ ／ ｃ ｍ、 电流 ３ ０ ０ ｍＡ、 ４℃ 电泳
不 同时 间同组 平行 样本 的图像 没 有 明显 变 化 （ 图
） 。表 １为经 Ｈ Ｏ 处理 后 ３个剂 量组 的彗 星 损伤 测 为０ （ 阴性对 照） 、 ２ ５ Ｉ ． Ｌ ｍｏ ｌ ／ Ｌ和 ５ ０ Ｉ ． Ｌ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ３ ７℃ 水 １ ｄ后 对 照组 的损 伤指 标 与 ２ ５ Ｉ ． Ｌ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 浴， ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， 离 心弃 上清 ， 洗 涤 ２次 ， 调 细 胞 浓度 为 １× 定 结 果 。保存 ５
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２ ０ ０ ７正
１ ２月
首 都 医 科 大 学 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃ ａ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｌ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ２ ８ Ｎｏ ． ６
第２ ８卷 第 ６期
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技 术 方 法
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单 细胞 电泳凝 胶 片 的保 存 方法
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星试验
单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。
因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。
因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。
遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。
人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。
为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。
它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。
研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。
此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。
ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。
ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺和甲基磺酸乙酯给药周期的筛选研究
大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺和甲基磺酸乙酯给药周期的筛选研究目的：筛选大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺（CP）和甲基磺酸乙酯（EMS）的给药周期。
方法：将SD大鼠随机分为空白对照组、CP组（40 mg/kg，腹腔注射）和EMS组（100 mg/kg，灌胃），每组9只，每24 h给药1次，连续给药4次。
分别于第2、3、4次给药后3 h（即首次给药后27、51、75 h）各组随机选取3只大鼠，处死并收集肝和胃样本，经过制备单细胞悬液、制片、裂解、解链、电泳及染色后，使用Comet Assay Ⅳ彗星试验数据分析系统进行分析，以彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾长（TL）和尾矩（TM）为评价指标，筛选最佳给药周期。
结果：空白对照组大鼠3个检测时间点肝和胃的Tail DNA%、TL、TM差异均无统计学意义（P>0.05），表明彗星试验体系比较稳定。
与空白对照组比较，CP组和EMS组大鼠3个检测时间点肝和胃的Tail DNA%、TL（27 h的胃除外）、TM均明显升高（P＜0.05）。
其中，CP组大鼠3个检测时间点间肝的Tail DNA%、TL、TM差异均无统计学意义（P>0.05），胃的Tail DNA%、TL均在给药51 h时最大，TM随给药时间的延长而升高；EMS组大鼠肝的Tail DNA%、胃和肝的TM均随给药时间的延长而升高。
EMS组大鼠胃的Tail DNA%、肝和胃的TL均在给药51 h时最大。
结论：在进行体内碱性彗星试验时，建议CP和EMS的给药周期是每24 h给药1次，连续给药3次。
ABSTRACT OBJECTIVE：To screen the dosing period of positive drug cyclophosphamide （CP）and ethyl methanesulfonate （EMS）in alkaline comet assay of rats in vivo. METHODS：SD rats were randomly divided into blank control group，CP group （40 mg/kg，i.p.）and EMS group （100 mg/kg，i.g.），9 rats in each group，every 24 h，for consecutive 4 times. 3 h after secondary，third and forth medication （27，51，75 h after first medication），3 rats were randomly selected and sacrificed in each group. Liver and stomach samples were collected. After single cell suspension preparation，production，lysis，chain breaking，electrophoresis and dyeing，the evaluation indicators，including tail DNA%，tail length （TL）and tail moment （TM），Comet Assay Ⅳcomet assay data analysis system was used to screen the optimal dosing period. RESULTS：There was no statistical significance in Tail DNA%，TL and TM of liver and stomach in blank control group at 3 test time points （P>0.05），indicating that the comet assay system was stable. Tail DNA%，TL （except for stomach at 27 h）and TM of liver and stomach in CP and EMS groups were increased significantly，compared with blank control group （P＜0.05）. There was no statistical significance in Tail DNA%，TL and TM of liver in CP group at the three test time points （P>0.05），tail DNA% and TL of stomach in CP group were maximal at 51 h. TM was increased with dosing period. Tail DNA% of liver in EMS group，TM of stomach and liver were increased with dosing period. Tail DNA% of the stomach，TL of liver and stomach were the highest at 51 h in EMS group. CONCLUSIONS：During in vivo alkaline comet assay，it is recommended that CP and EMS be administered once every 24 h andthree times continuously.KEYWORDS Alkaline comet assay in vivo；Cyclophosphamide；Ethyl methanesulfonate；Dosing period；Rats彗星试验（Comet assay），又称单细胞凝胶电泳试验（Single cell gel electrophoresis assay），是一种快速、简单、可视化、灵敏的试验技术，可以直接测量和分析体内外细胞的核DNA损伤[1-2]。
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彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？
1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和
细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
的，我怕脱胶，是把玻片放在搪瓷盘中水平裂解、中和的。
听说有人是放在染色缸里垂直的都不会脱胶，我真愁死了，请教大侠载玻片规格磨砂程度，在哪里买的，盖玻片规格呢？裂解、电泳、中和的细节问题能否给点指导呢？能够得到您的帮助将非常感谢！
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指。