紫外分光光度法和荧光分析法-讲义
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分子荧光分析法实验讲义
5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样
架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测
3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”
图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。
若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开
关，开启电脑。预热仪器20分钟。
2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0,
4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
紫外可见分光光度法基本原理PPT讲稿
光是由光子流组成，光子的能量：
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
E=h=hc/
（Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J × S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
生的吸收光谱在紫外—可见光区，称为紫外—可见光谱或分子的 电子光谱。
讨论：
（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的 能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性 的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关， 也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩 尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能 相同，但εmax不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比， 这是定量分析的依据。
* σ σ* (150~210nm)
H
* n σ* (259nm)
HCI
H
（2）不饱和脂肪烃
• 这类化合物有孤立双键的烯烃(如乙烯)和共轭双键的烯
烃(如丁二烯)，它们含有π键电子，吸收能量后产生
π→π*跃迁。乙烯(孤立双键)的
m
a
为171nm(
x
＝
15530 L mol1 cm1 )；而丁二烯H(2C CH CH CH2 )
列吸收带，称为精细结构吸收带，亦称为B吸收带[从德文 Benzenoid(苯的)得名]，这是由于跃迁和苯环的振动的重叠引起的。B 吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物。 苯环与生色团连结时，有B和K两种吸收带，有时还有R吸收带，其中 R吸收带的波长最长 。
生色团与助色团
生色团(Chromophore)： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生
紫外分光光度法和荧光分析法
差示分光光度法
▪ 一般分光光度法一般只适于测定微量组分， 当待测组分含量较高时，将产生较大旳误差。 需采用示差法。
▪ 即提升入射光强度，并采用浓度稍低于待 测溶液浓度旳原则溶液作参比溶液。
▪ 设：待测溶液浓度为cx，原则溶液浓度为 cs(cs < cx)。则：
▪ Ax= εb cx As = εb cs
4.构造分析
▪ 1.鉴别物质旳异构体，如互变异构体， 顺反异构体，开链和成环异构体，旋 光异构体，空间异构体等。反式异构 体空间位阻小，共轭程度较完全。最 大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数， 不小于顺式。
▪ 2.推测物质旳共轭体系和部分骨架 ▪ 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等
多种仪器联合作物质旳构造分析。
▪ 激发单色器 ： 置于光源和样品室之间旳为激发单色器或第一单
色器，筛选出特定旳激发光谱。
▪ 发射单色器：置于样品室和检测器之间旳为发射单色器或第二
单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定旳发射光谱
▪ 样品室： 一般由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样
品)构成。
▪ 检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大
并转为电信号。
荧光分析法与紫外-可见分析法异同点
荧光分析法与紫外-可见比较： 均属于分子光谱 仪器构造 基本相同
荧光
可见-紫外
本质
发射光谱
吸收光谱
敏捷度 选择性
10-10-10-12 g/ml 高
10-4-10-7g/ml 一般
应用
硫色素荧光法测定维生素B1
维生素B1 在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，在紫（365nm）
②物质对光吸收呈加和性旳原理，即在某一样品旳吸收曲线上， 各波长旳吸光度是维生素A与杂质吸光度旳代数和，因而吸收曲线 也是两者吸收旳叠加。
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较
紫外可见分光光度法和分子荧光光度法，是两种现代分析化学中常用的光度测定技术，它们之间有许多不同之处。
首先，紫外可见分光光度法可以用来测量悬浮液和溶液中某种物质含量，通过检测它
们吸收波长不同的光，并使用紫外可见分光仪可以很好地用来定量分析一种物质的含量，
主要原因是它可以采用强度谱的方式测定光谱分析，这是数据量最大的分光光度法。
而分子荧光光度法则与紫外可见分光光度法存在很大的不同。
分子荧光光度法是一种
用于测定物质的定量分析的光度测量技术，其原理是通过激发某种物质的激发状态，并采
用光谱分析的方式测定淬发状态下某种物质吸收的光谱，采用发射率谱测量它发射出来的
光谱，这种方法有利于识别样品中含量很小的物质。
此外，两种光度测量技术在检测样品中的某种物质的含量时也有很大的差异。
紫外-
可见分光光度法通常可以测到复杂样品中有结构特性的物质，因此适用于分析各种复杂混
合样品，分子荧光光度法则是通过向某种物质添加少量共振激发剂来标记样品中某种物质，然后进行定量分析，它可以清楚地测量某种独特结构物质，因此被广泛应用于纯化和同位
素比值等细胞研究中，并可以更明确地测量和筛选出某种物质。
综上所述，紫外可见分光光度法和分子荧光光度法是两种现代分析化学中常用的光度
测定技术，它们在原理，应用，检测样品中含量的某种物质等方面都存在差异，根据实际
情况和需要，可以依据自身需要选择不同的光度测量技术，以获得更准确的定量分析结果。
紫外分光光度法和荧光分析法..
波长紫外可见分光光度计
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 （例子：课本366页）
在溶液中，当荧光物质 的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系,即
IF=KC
光照 分子基态 辐射跃迁 荧光 激发态
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子 可见-紫外光源 分子荧光分析法 具有结构 由荧光强度可测物质的含量 原子特征光谱作光源 原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法 小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
导数分光光度法
导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、
紫外分光光度法和荧光分析法课件PPT
造成污染。
实验操作规范
仪器校准
在进行实验前，应确保紫外或 荧光分光光度计已经校准，以
确保测量结果的准确性。
样品处理
对于荧光分析法，样品应进行 适当的预处理，如过滤、离心 等，以去除杂质和悬浮物。
试剂纯度
实验所用的试剂应保证纯度， 避免杂质干扰实验结果。
操作顺序
在实验过程中，应按照规定的 操作顺序进行，避免因操作不
05
实验操作注意事项
安全注意事项
01
02
03
04
眼睛保护
实验操作过程中，应佩戴合适 的护目镜，以防紫外线或荧光
物质对眼睛造成伤害。
皮肤保护
操作紫外或荧光实验时，应穿 着长袖实验服，并佩戴手套，
以减少皮肤暴露。
避免吸入有害物质
实验过程中应保持室内通风良 好，以防有害气体积累。
废弃物处理
实验结束后，应按照相关规定 妥善处理废弃物，避免对环境
实验操作
实验操作主要包括样品处理、荧光激发和荧光测量三个步骤。样品处理是将待测物质提取、纯化、稀释等操作， 以便进行后续的荧光测量。荧光激发是通过特定波长的光激发样品中的荧光物质，产生荧光。荧光测量则是通过 光电倍增管等设备测量荧光的强度和光谱，并记录数据。
应用实例
01Biblioteka 0203环境监测
荧光分析法可用于水体、 土壤等环境样品中的重金 属、农药残留等有害物质 的监测。
人才培养与交流
1
2
加强紫外分光光度法和荧光分析法领域的人才培 养，提高专业水平。
3
加强国际间的学术交流与合作，推动该领域的快 速发展。
谢谢观看
紫外分光光度法和荧光分析法课件
目录
• 引言 • 紫外分光光度法 • 荧光分析法 • 比较与选择 • 实验操作注意事项 • 课程总结与展望
实验操作规范
仪器校准
在进行实验前，应确保紫外或 荧光分光光度计已经校准，以
确保测量结果的准确性。
样品处理
对于荧光分析法，样品应进行 适当的预处理，如过滤、离心 等，以去除杂质和悬浮物。
试剂纯度
实验所用的试剂应保证纯度， 避免杂质干扰实验结果。
操作顺序
在实验过程中，应按照规定的 操作顺序进行，避免因操作不
05
实验操作注意事项
安全注意事项
01
02
03
04
眼睛保护
实验操作过程中，应佩戴合适 的护目镜，以防紫外线或荧光
物质对眼睛造成伤害。
皮肤保护
操作紫外或荧光实验时，应穿 着长袖实验服，并佩戴手套，
以减少皮肤暴露。
避免吸入有害物质
实验过程中应保持室内通风良 好，以防有害气体积累。
废弃物处理
实验结束后，应按照相关规定 妥善处理废弃物，避免对环境
实验操作
实验操作主要包括样品处理、荧光激发和荧光测量三个步骤。样品处理是将待测物质提取、纯化、稀释等操作， 以便进行后续的荧光测量。荧光激发是通过特定波长的光激发样品中的荧光物质，产生荧光。荧光测量则是通过 光电倍增管等设备测量荧光的强度和光谱，并记录数据。
应用实例
01Biblioteka 0203环境监测
荧光分析法可用于水体、 土壤等环境样品中的重金 属、农药残留等有害物质 的监测。
人才培养与交流
1
2
加强紫外分光光度法和荧光分析法领域的人才培 养，提高专业水平。
3
加强国际间的学术交流与合作，推动该领域的快 速发展。
谢谢观看
紫外分光光度法和荧光分析法课件
目录
• 引言 • 紫外分光光度法 • 荧光分析法 • 比较与选择 • 实验操作注意事项 • 课程总结与展望
生物分析实验一_紫外分光光度法与荧光分析法
三、被测样品的要求
1、含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因 此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波 长。
2、当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定供试 品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合 要求
四、定性分析
根据物质的吸收光谱的特征吸收光谱的形状、吸收峰的 数目、吸收峰的位置（波长）、吸收峰的强度、相应的吸 光系数进行定性分析。
CX=(AX/AR)CR CX为供试品溶液的浓度； AX为供试品溶液的吸收度； AR为对照品溶液的浓度； CR为对照品溶液的吸收度。
2、吸收系数法
按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其 吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。
CX
AX
/(E
1%
1cm
100)
EHale Waihona Puke 1% 1cm紫外分光光度法 与荧光分析法
紫外分光光度法
一、紫外分光光度法的特点
1、灵敏度高，可达10-4~10-7g/ml 2、准确度高，相对误差为2%~5% 3、仪器价格较为廉价，操作简单 4、应用广泛（可以用此法不经分离直接测定混合物中各组分含量）
二、紫外分光光度计
光源
氢、氘灯;可发射185～400 nm的连续光谱
单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长 单色光的光学系统。
样品室
样品室放置各种类型的比色皿。比色皿材质主要有石英和 玻璃两种。在紫外区须采用石英比色皿。
检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号， 常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
显示
由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动。 因此，除了定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测 定前校正测定波长。
紫外分光光度法和荧光光度法的对比
紫外分光光度法和荧光光度法的对比
紫外分光光度法和荧光光度法是两种不同的光学分析方法，下面进行一些对比：
1.原理：紫外分光光度法基于物质对于紫外光的吸收特性，而荧光光度法基
于物质在特定波长的光的作用下产生的荧光效应。
2.应用范围：紫外分光光度法常用于测定物质在紫外区的吸收光谱和吸光度，
适用于有机化合物、络合物等；而荧光光度法常用于测定物质在可见光区的荧光光谱和荧光强度，适用于荧光物质、高灵敏度分析等。
3.灵敏度：荧光光度法的灵敏度通常比紫外分光光度法高，可以检测到更低
浓度的物质。
4.干扰因素：紫外分光光度法受到溶剂、pH值等干扰因素影响较大，需要精
心选择和调节；而荧光光度法受到的干扰因素相对较少。
5.样品要求：紫外分光光度法对样品的纯度要求较低，可以直接测定；而荧
光光度法对样品的纯度要求较高，需要预先进行提纯和浓缩。
6.测量时间：紫外分光光度法测量时间较短，可以快速得到吸收光谱和吸光
度；而荧光光度法测量时间较长，需要等待样品达到稳态荧光。
综上所述，紫外分光光度法和荧光光度法各有其优缺点，根据具体的分析需求和样品特性选择合适的方法。
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4.结构分析
▪ 1.判别物质的异构体，如互变异构体， 顺反异构体，开链和成环异构体，旋 光异构体，空间异构体等。反式异构 体空间位阻小，共轭程度较完全。最 大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数， 大于顺式。
▪ 2.推测物质的共轭体系和部分骨架 ▪ 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等
多种仪器联合作物质的结构分析。
▪ ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc
▪ 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与
标准溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法测得的
吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得 相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ： ▪ cx = cs + Δc
双波长分光光度法
▪ 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两 束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。
▪ Ｉ＝Ｉ0 e-εbc
▪ 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定：
▪ dI 0 /dλ＝0
▪ 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ
▪
＝－Ｉ0 bc dε/dλ
▪ （例子：课本233页）
其他
▪ 卡尔曼滤波法 ▪ 偏最小二乘法 ▪ 小波变换 ▪ 三波长分光光度法 ▪ 系数倍率法 ▪ ……
紫外分光光度法和荧光分析法
精品jin
基本原理 仪器主要部件
主要应用
基本原理
概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物 质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长 范围内光的吸收度，对该物质进行定性和 定量分析的方法。主要用于药品的鉴别、 检查和含量测定。
范围： 紫外光区（200~400nm）
可见光区（400~760nm）
IF=KC
光照
分子基态
激发态
辐射跃迁 荧光
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子
可见-紫外光源
分子荧光分析法
具有结构 由荧光强度可测物质的含量
▪ ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c ▪ 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度
成正比
▪ （例子：课本366页）
导数分光光度法
▪ 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、 消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱 的辨析等方面，显示了很大的优越性。
▪ 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分 析：
仪器主要部件
光源
单色器 吸收池 检测器
信号显 示系统
光 源: 常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为320～1000nm。 氘灯能发出光的波长范围一般为190～400nm
单色器：棱镜或光栅
吸收池：玻璃或石英吸收池
检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器
仪器分类
▪ 单光束紫外可见分光光度计 ▪ 准双光束紫外可见分光光度计 ▪ 双光束紫外可见分光光度计 ▪ 双波长紫外可见分光光度计
②物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线上， 各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收曲线 也是二者吸收的叠加。
3、药物的鉴别
对比吸收光谱特征数据 对比吸收度（或吸收系数）的比值 对比吸收光谱的一致性
例 苯磺舒：用含盐酸的乙醇[取盐酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成 100ml]制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长处有 最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 。 甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在 239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.57~0.60;在239nm与 263nm波长处的吸光度比值应为2.25~2.45
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光—分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象
利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
在溶液中，当荧光物质 的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系,即
紫外分光光度测定方法
▪ 普通测定分光光度法
▪ 1.单组分的测定 ▪ 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 ▪ 2.多组分的同时测定 ▪ ⑴若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自
最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组 分测定没有区别。 ▪ ⑵若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸 光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 ▪ Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb ▪ Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb
如巴比妥类药物的含量测定（巴比妥类药物 在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构）、 芳酸及其脂类药物含量测定、维生素A含量测定 （在325~328nm的波长范围内有最大吸收）等。
三点校正法
本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度 校正值后，再计算含量。其原理主要基于以下两点：
①杂质的无关吸收再310~340nm的波长范围内几乎呈一条直线， 且随波长的增大吸光度下降。
Beer-Lambort
*A为吸收度；
定律A=logห้องสมุดไป่ตู้
1 T
=Ecl
*T为透光率；
*E为吸收系数（以
E
1% 1cm
） 表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值
*c为溶液浓度；
*l为样品总厚度。
适用条件：入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体样品在同一波长 下，各组分吸光度具有加和性
差示分光光度法
▪ 普通分光光度法一般只适于测定微量组分， 当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。 需采用示差法。
▪ 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待 测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。
▪ 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为 cs(cs < cx)。则：
▪ Ax= εb cx As = εb cs
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。
例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
2、药物的含量测定