基因工程简介 2009
基因工程概述
1 . “鸟枪法”（“散弹射 击法”）
用限制酶将供体细胞中 的DNA切成许多片段，将这 些片段分别载入运载体，然 后通过运载体分别转入不同 的受体细胞，让供体细胞提 供的外源DNA的所有片段分 别在各个受体细胞中大量复 制（即扩增），从中找出含 有目的基因的细胞，再利用 一定方法将目的基因的DNA 片段分离出来。
思考：依照中心法则分析番茄软化的原因：
多聚半乳糖酸酶基因 转录 mRNA 翻译 多聚半乳糖酸酶
细胞壁结构被破坏
番茄软化
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1、DNA测序仪：
能快速地测定DNA 样品的碱基序列。
2、PCR技术：
在体外通过酶促反应 有选择的大量扩增目的 基因或序列的技术。
概念的把握
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 优点 本质
DNA重组技术 体外 基因
分子水平 剪切→ 拼接 →导入→ 表达 获得人类需要的基因产物
定向改造生物 基因重组
（二）基因工程的工具——酶和载体
关键步骤一的工具： “分子手术刀”—限制性内切酶 关键步骤二的工具： “分子针线”—DNA连接酶 关键步骤三的工具： “分子运输车”—载体
步骤四：筛选出获得目的基因的重组细胞
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
步骤五：培养受体细胞并诱导目的基因的表达
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因 完成了表达吗？ 重组的DNA分子进入受体细胞后受体细 胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基 因完成了表达过程。
若不能表达， 要对抗虫基因 再进行修饰。
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径， 如土壤农杆菌转化法。
基因工程简介1240页
例1: 治疗侏儒症的唯一方法，是向人体 注射生长激素。而生长激素的获得很困难。 以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大 脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。
现可利用基因工程方法，将人的生长激 素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。 人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长 激素，相当于6万具尸体的全部产量。
例2:将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗 盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作 物体内，将从根本上改变作物的特性。如转 基因抗虫棉。
例3:将人的生长 激素基因和牛的生长 素基因分别注射到小 白鼠受精卵中，得到 的“超级小鼠”。
• 例4:基因治疗：
是患指半是乳把糖血健症康的患外者源，基由因于导细入胞有内基半因乳缺 陷 糖苷的转细移胞酶中基，因达缺到陷治而疗缺疾少病半的乳目糖的苷。转移酶， 使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等 功能受损。
基因 DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达 人类所需要的产品
原 理： 基因重组
基因工程培育抗虫棉
•苏云金芽孢杆菌→抗虫基因 →棉的细胞→抗虫棉
抗虫基因的结构有什么特点？
（二）、基因操作的工具
1、基因剪刀——限制性内切酶（限制酶）
限制性内切酶作用过程
（二）、基因操作的工具
1、基因剪刀——限制性内切酶（限制酶）
—G↓GATC C— 用酶Ⅰ切割 —C CTAG↑G—
—G —CCTAG
GATCC— G—
2、基因的针线——DNA连接酶
• 连接酶的作用： 将互补配对的两个黏性末端连接起来
，使之成为一个完整的DNA分子。 • 连接的部位：
磷酸二酯键，不是氢键。
DNA连接酶的作用过程
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DNA连接酶的作用过程
基因工程简介
3.3基因工程简介一、基因工程（重组DNA技术/基因拼接技术）概念：又称为基因拼接技术或DNA重组技术，在生物体外，将目的基因经过“剪切”“拼接”重组后，导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。
操作环境操作对象操作水平特点变异类型目的体外基因分子水平定向改造生物基因重组获得目的基因产物实例：基因工程培育抗虫棉剪切苏云金芽孢杆菌的抗虫基因→与质粒拼接→将重组质粒导入棉花体细胞或受精卵→经植物组织培养培育抗虫棉二、基因操作的工具基因工程中有两个难题①如何在众多基因中找到并剪切所需的目的基因②如何将目的基因与运载体拼接1、基因的剪刀—DNA限制性内切酶（简称限制酶）分布特点作用结果原理微生物(主要) 专一性识别特定核苷酸序列(一般是回文序列)，并在特定切点上切割DNA分子产生黏性末端水解磷酸二酯键回文序列：正向反向阅读一样的序列黏性末端：被限制酶切割后的DNA切口不是平齐的，而是带有几个伸出的脱氧核苷酸构成单链，两段伸出的单链可配对，将这样的切口称为黏性末端。
2、基因的针线—DNA连接酶作用：使两个具有黏性末端的DNA分子连接起来原理：催化形成磷酸二酯键（形象的说，连接的是梯子的扶手而不是踏板）区分：RNA（DNA）聚合酶的作用是催化RNA（DNA）的合成3、基因的运输工具—运载体作用①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（克隆）条件①能在宿主细胞内复制并稳定地保存②具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有某些标记基因(抗药性基因、颜色反应基因等)，便于筛选种类质粒（如大肠杆菌质粒、土壤农杆菌质粒）、噬菌体、动植物病毒质粒：细菌和酵母菌细胞质中存在的一种小型环状DNA分子，可自主复制小资料：①在基因工程中，常用人工构建的质粒作为运载体，人工构建的质粒由天然质粒改造而成，能较好的满足运载体所要求的三个条件。
如改造后的大肠杆菌pBR322质粒含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，有5种限制酶的单一切点，并且切割时不会破坏抗性基因。
基因工程概述
基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制，转录，翻译外援目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
基因工程的目标是实现转基因生物性状的定向改良，技术上包括基因或DNA 的体外重组，转基因，重组子筛选与扩大繁育等多个环节，目的性和技术性都很强，需要严密的实验设计。
基因工程的技术流程包括以下几个基本环节：目的基因克隆，载体的准备，目的基因与载体的连接，重组DNA转化/转染/转导，重组体的筛选与鉴定，最后是重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用。
从技术流程来看，基因工程包括四个基本条件：目的基因，载体，工具酶以及宿主细胞。
基因工程的发展经历了理论和技术的酝酿，诞生和快速发展等几个阶段。
遗传物质DNA 的确定，DNA双螺旋结构的提出以及半保留复制机制的届是以及中心法则的提出为基因工程的诞生奠定了理论基础，而限制性内切酶核酸，连接酶的发现，载体的应用以及大肠杆菌转化体系的建立则为基因工程的诞生奠定了重要的技术基础。
基因工程能够真正应用离不开酶学，DNA重组技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的，特别是限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外切割与连接真正成为可能。
通过切割相邻两个核苷酸残疾之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶，把应用于基因工程的各种核酸酶统称为基因工程的工具酶。
基因工程中常用的工具酶有：限制性内切核酸酶（特异切割DNA），DNA连接酶（DNA 片段间连接，产生重组DNA分子），DNA聚合酶Ⅰ（切口平移制作高比活探针；3’突出末端DNA分子标记），Klenow片段（3’凹陷末端的补平；双链DNA 3’末端标记；延伸寡核苷酸引物合成探针），TaqDNA聚合酶（PCR），反转录酶（合成cDNA），碱性磷酸酶（去磷酸化，防止载体自身连接），RNA酶（去除基因中的RNA）。
基因工程
中文名称：基因文库英文名称：gene library学科分类：遗传学注释：一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。
将这些载体导入到受体细菌或细胞中，这样每个细胞就包含了一个基因组DNA 片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多细胞一起包含了该生物全部基因组序列，我们将这一个集合体叫做基因文库。
基因文库gene library用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
同一定义也适用于某种生物的线粒体DNA或叶绿体DNA的基因文库。
由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。
基因文库与基因库的概念不同。
基因库是指某一生物群体中的全部基因。
基因文库与基因克隆的概念也有区别，基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。
基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。
人们为了分离基因，特别是分离真核生物的基因，从1974年起相继建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的线粒体和叶绿体DNA的基因文库。
基因文库的建立使分子遗传学和遗传工程的研究进入了一个新时期。
基因文库的建立一个基因文库中应包含的克隆数目与该生物的基因组的大小和被克隆DNA片段的长度有关。
原核生物的基因组较小，需要的克隆数也较少；真核生物的基因组较大，克隆数需相应增加，才能包含所有的基因。
基因工程简介
3.实施基因工程的第一步的一种方法是把所需的基因从供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切
酶。一种限制性内切酶能识别ＤＮＡ分子的ＧＡＡＴＴＣ顺主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用 是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。
例：大肠杆菌的一种EcoRI限制酶识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
EcoRI
使用EcoRI 剪切目的基因
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCACAGTTACGCCTAA GGCGATCT TTAA
）
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中
② 将编码毒素蛋白的ＤＮＡ序列，注射到棉受精卵中 ③将编码毒素蛋白的ＤＮＡ序列，与质粒Ｃ重组，导入
细菌，用该细菌感染棉的体细胞，在进行组织培养
④将编码毒素蛋白的ＤＮＡ序列，与细菌质粒重组，
注射到棉的子房并进入受精卵中
Ａ．①②
Ｂ. ②③
Ｃ. ③④
Ｄ. ④①
谢谢观赏
3、基因的针线──DNA连接酶
DNA连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的 DNA分子。
使用DNA连接酶制作重组使D用NAD分NA子连接酶制作重组DNA分子
AATTCCGTAG GGCATCTTAA
CTTCATG GAAGTACTTAA
AATTCACAGTTACGCCTAA GGGGGCAATTTCTTAA
基因工程简介
中国首例转基因猕猴
在紫外线照射下，转基因猕猴（左）通 体呈现绿色，这是由它体内的绿色荧光 蛋白所致。
3.3基因工程简介27页PPT文档
基因操作的工具
基因的剪刀——限制性内切酶（一种限 制酶只能识别一种特定 的核苷酸序列，并且能 在特定的切点上切割 DNA分子）
基因的针线——DNA连接酶
基因的运输工具——运载体（如质粒、 噬菌体和动植物病 毒等）
限制性内切酶
被限制酶切开
的DNA两条单链 的切口，带有几个
伸出的核苷酸，它
们之间正好互补配
将目反的转基录因法导入专菌 （受一的抗体性抗病细强虫毒胞操 定基、作，因抗过要，细求程还菌的麻有）技烦植基术，物因条mR的 、N件A抗 种很较不高病 子稳 目的基因的检测贮和藏表蛋达白的基因，以及人的胰岛
检测合化：成学通法过检测素专标最一基记强性因基、因仅 简的干单限有扰基于无素来合因基判成因断核等目苷的。酸基对因较是少否的导入。
运载体的作用：
1、作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。 2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量
复制。
运载体必须具备的条件：
1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接； 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素
的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ）
基因工程的基本内容
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。这种 技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和 “拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入 受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达， 产生出人类所需要的基因产物。
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果
基因工程简介
生物工程
概念：也叫生物技术，是生物科学与工程技术有 机结合而兴起的一门综合性科学技术。
特点：以生物科学为基础，运用先进的科学原理 和工程技术手段来加工或改造生物材料， 如DNA、蛋白质、染色体、细胞等，从而 生产出人类所需要的生物或生物制品。
基因工程简介
（三）基因操作的基本步骤
• 四个基本步骤：图3-15 1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达
（三）基因操作的基本步骤
• 目的基因的提取方法 直接分离基因 ：鸟枪法(适用于原核细胞)
基因“拼接”技术之所以能成功的原理是？ 抗虫基因能在棉花体细胞中成功表达的原理
又是什么？
（二）基因操作的工具
• 基因的针线——DNA连接酶
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙 “缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连 接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。
（二）基因操作的工具
• 作为运载体必须具备哪些条件？
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。
第三章 第四节
基因工程简介
1）基因工程的概念 2）基因操作的工具 3）基因操作的基本步骤
（二）基因操作的工具
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
基因的剪刀——限制性内切酶 基因的针线——DNA连接酶 基因的运载工具——运载体
（二）基因操作的工具
• 基因的剪刀—限制性内切酶（简称限制酶)
限制 酶
人工合成基因 反转录法 (适用于真核细胞) 根据已知的氨基酸序列
合成DNA
• 步骤二：目的基因与运载体结合
（三）基因操作的基本步骤
• 步骤三：目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵 母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理:
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径.将细菌用 CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性
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5
6
转 基 因 技 术
甲生物
取出优 “剪切” 秀基因 “拼接”
乙生物
表达
新类型
新的生物产品
基 因 敲 除 技 术
生物
敲 除 不 利 基 因
新类型
新的生物产品
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一、基因操作常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
识别特异序列，切割DNA 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯 键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
——1972～1973年，Berg和Cohen将成功 完成首个基因工程操作。
2
• 基因工程的主要操作步骤：
• 切——切开载体；切除供体DNA获得目的基 因； • 接——将目的基因与载体连接，（重组子）； • 转——将重组子转移到受体细胞中，(重组体); • 检——检查目的基因的转移和表达效果
3
体 外 操 作 与 细 胞 内 表 达
导入
扩增
3 导入途径
包括 生物法：转化、转染、 化学法：多聚物介导（如聚乙二醇） 物理法：显微注射、电穿孔、粒子轰击法
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Hale Waihona Puke （四）目的基因的检测和表达
前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用， 通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的 受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出 来。
8
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
• １、限制性内切酶（限制酶）
• 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在 特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的 限制酶有200多种。 • ①分布：主要在微生物中。 • ②作用特点：特异性，即识别核苷酸序列，切割特 定切 点。 • ③结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 • ④举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
27
②
①
③
分子杂交实验
28
目录
13
二、基因的运输工具—运载体
要让一个从甲 生物细胞内取出来 的基因在乙生物体 内进行表达，首先 得将这个基因送到 乙生物的细胞内去！ 能将外源基因送入 细胞的工具就是运 载体。
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1. 质粒载体（Plasmid）
• 质粒是指微生物细胞内 染色体外能自主复制的 裸露、双链、闭合环状 DNA分子，其大小可以从 1kb到500kb左右。 • 质粒的存在非常普遍， 几乎所有的细菌株系都 含有质粒。 • 可克隆的外源DNA片段一 般不超过10kb，能够在 受体细胞内利用受体细 胞的酶系统进行复制。
9
DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性 末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相 同的黏性末端，能够通过互补进行配对。
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2、 DNA连接酶─基因的针线
• 连接酶的作用是： 将互补配对的两个 黏性末端连接起来， 使之成为一个完整 的DNA分子。 • 能够催化DNA中相 邻的3’-羟基和5’磷酸基末端之间形 成3′，5′-磷酸二 酯键，
18
RNA PCR 的原理图
19
（二）目的基因与运载体结合
用与提取目的基 因相同的限制酶切割 质粒使之出现一个切 口，将目的基因插入 切口处，让目的基因 的黏性末端与切口上 的黏性末端互补配对 后，在连拉酶的作用 下连接形成重组DNA分 子。 20
（三）将目的基因导入受体细胞并使之扩增
要让目的基因表达，必 须将它导入受体细胞并进行 扩增。 为获得目的基因的表达 产物时，通常以大肠杆菌等 无害易得的细菌为受体。为 改进某种生物时，将欲改进 的生物细胞为受体。 为使重组的DNA分子更容易 进入受体细胞，通常还要用 一些物质对受体细胞进行处 理，使受体细胞具有更大的 通透性。 21
例：用棉铃饲喂棉铃 虫，如虫吃后不出现中毒 症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。 如虫吃后中毒死亡，则说 明摄入了抗虫基因并得到 表达。
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抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
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印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌 落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留 有表达产物的进一步培养、研究。
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多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育 成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否 表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相 应变化的个体进一步培养、研究。
用限制酶切 断成许多片段
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2.人工合成基因法
DNA合成仪
有两种方法： ①逆转录法：以信使 RNA为模板，在逆转录酶 的作用下将脱氧核苷酸合 成合成DNA(基因)。 ②直接合成法：根据 蛋白质的氨基酸顺序推算 出信使RNA核苷酸顺序， 再据此推算出基因DNA的 脱氧核苷酸顺序。用游离 脱氧核苷酸直接合成相应 的基因。
第 14 章 基 因 工 程 简 介
王章存 2011.06
1
基因工程的概念
也叫基因拼接技术或DNA重组技术。 它是在生物体外，通过对DNA分子进行人工 “剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和 重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖， 使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需 要的基因产物，也可定向地改造生物的遗传性状。
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Taq DNA 聚合酶 (Thermus aqraticus)
• 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 • 结构：单亚基MW=94000d。 • 活性：聚合最适温度为75-80℃，不具3′→5′ 外切酶活性，具5′→3′外切活性 。 • 用途： PCR反应。 测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结 构。
DNA聚合酶Ⅰ
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 , (4) 填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚 合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第 二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
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三、基因操作的基本步骤
（一）目的基因的获鸟枪法（基因法）；PCR法（人工合成法）
供体生物细胞
取出DNA 用限制酶剪 去多余部分
限制酶
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目的基因
提取目的基因的方法 1. 直接分离基因——鸟枪法
将供体生物的DNA用限制酶 切割为许多片段，再用运载体将 这些片段都运载到受体生物的不 同细胞中去。只要有一个细胞获 得了需要的目的基因并得以表达， 基因工程就算成功了。 该法最大的缺点是带有很大 的盲目性，工作量大，成功率低。 且不能将真核生物的基因转移到 原核生物中去。
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3. DNA 聚合酶 （DNA polymerase）
DNA聚合酶
指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖 核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’ -OH末端聚合 DNA链的一类酶。 DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。 DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ（polⅠ）， 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ 参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA复制。聚合酶Ⅰ 是基因工程中的常用酶。