分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
微生物的分子鉴定
微生物的鉴定流程12传统微生物鉴定简述3分子生物学鉴定1.微生物的鉴定流程流程：传统分类鉴定法现代分类鉴定法2. 传统微生物鉴定简述鉴定指标:（1）菌落形态（2）菌体形态细菌：真菌：（3）理化特征淀粉水解实验代谢产物特征（4）不足传统的鉴定的主要依据是形态特征、理化特征、生态特征和血清学特征，需要进行微生物的培养及一系列生化反应或免疫学检测。
其缺点是检测项目多、工作量大、复杂耗时、结果不稳定，易出现弱反应或假阳性，存在明显的不足。
分子生物学操作简单，鉴定快速，且准确性高，现常用于菌种的鉴定。
3. 分子生物学鉴定16SrDNA鉴定法：利用了PCR的方法，根据16s rDNA两端的保守序列，设计引物PCR扩增未知细菌的16s rRNA基因，然后对PCR扩增的DNA片段进行序列分析，经与GenBank中的已知序列进行同源性比较后，对未知菌种进行鉴定。
该方法是在分子水平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性好等优点。
（1）具体流程：基因组的制备PCR 扩增 16sRNAPCR产物纯化阳性克隆鉴定，测序同源性分析，系统进化树建立（2）鉴定的原理细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和可变区组成。
细菌的rRNA包括5S、16S、23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析；23S rRNA分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌鉴定；相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在1550±200bp左右,代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。
目前已报道了15000种以上的细菌16S rDNA序列，通过对16S rDNA序列分析，可以将细菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法鉴定细菌尤为方便。
（3）鉴定的步骤①基因组DNA的制备从琼脂平板上挑出10个单菌落或从三角瓶中取200 μl菌液，采用细菌少量提取基因组DNA试剂盒提取各个样品的基因组DNA，4℃保存备做模板。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。
菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。
下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。
一、形态学鉴定1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。
2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。
二、生理生化特性鉴定1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。
可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。
2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。
三、分子生物学特征鉴定1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。
2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。
菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。
其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。
这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。
在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
细菌分子生物学鉴定
是的，要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下：1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。
吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。
（-80摄氏度保藏2年）2、提取DNA（CTAB法）：（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。
（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。
（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。
（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。
（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。
（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。
（纯化作用）（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
（11）电泳检测6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。
微生物检测技术的微生物鉴定方法与注意事项
微生物检测技术的微生物鉴定方法与注意事项随着生物技术和医疗技术的快速发展，微生物检测技术在医药、环境、食品等领域的应用越来越广泛。
微生物鉴定是其中重要的一环，它可以帮助我们确定不同种类的微生物以及它们对环境和人类健康的影响。
本文将介绍微生物检测技术的微生物鉴定方法以及一些注意事项。
一、微生物鉴定方法1. 直接显微镜观察直接显微镜观察是最简单直接的微生物鉴定方法之一。
通过放大镜或显微镜观察微生物的形态、大小、结构等特征，可以初步确定微生物的类型。
这种方法适用于一些常见的微生物，如真菌、细菌和原生动物等。
2. 培养和生长特性观察培养和生长特性观察是一种常用的微生物鉴定方法。
通过将微生物样本培养在适当的培养基上，观察其生长特点、菌落形态和色素等特征，可以初步确定微生物的类型。
这种方法通常需要较长的培养时间，但可以识别更多种类的微生物。
3. 生物化学试剂盒检测生物化学试剂盒检测是一种常用的微生物鉴定方法。
这种方法利用不同微生物在特定条件下产生的酶或代谢产物与试剂盒中的反应物之间的反应，通过观察反应结果判断微生物的种类。
生物化学试剂盒检测方法可快速、准确地鉴定微生物，适用于临床检测和食品安全监测等领域。
4. 分子生物学技术鉴定随着分子生物学技术的发展，分子生物学技术鉴定成为微生物鉴定的重要方法之一。
例如，聚合酶链式反应（PCR）技术可以通过扩增微生物特定的DNA序列，从而确定微生物的种类。
另外，测序技术可以通过测定微生物的基因组序列，识别微生物的种类和亚种。
分子生物学技术鉴定方法准确性高，但需要专业设备和操作技巧。
二、微生物鉴定的注意事项1. 样品采集与保存样品采集是微生物鉴定的关键步骤之一。
在采集样品时，应注意避免污染和交叉污染，使用无菌容器和工具，并避免直接接触。
对于不同类型的样品，采集方法和处理方式也不同，应根据具体情况进行。
在样品采集后，应妥善保存，并尽快送往实验室进行检测，避免样品变质或污染。
2. 实验室安全措施在进行微生物鉴定实验时，实验室安全是至关重要的。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程一般分为以下几个步骤：
1. 样品收集：根据需要鉴定的细菌类型和来源，选择适当的样品收集方式。
样品可以是细菌培养物、体液、食物等。
2. 培养：将样品接种到适当的培养基上进行培养。
根据细菌的生长条件需求，选择适当的培养基，如富含寡营养物的普通培养基、特殊选择性培养基等。
3. 盱衡生长：根据细菌类型和特性，观察细菌的生长状况，如菌落形状、颜色、大小等。
4. 形态学鉴定：使用显微镜观察细菌的形态学特征，包括细菌的形状（球形、杆状、螺旋形等）、大小、菌落或细胞的结构、芽生等。
5. 生化鉴定：进行一系列生化试验以确定细菌的生化特性，如氧需求、发酵产物、酶反应、代谢产物等。
6. 免疫学鉴定：通过免疫学方法，如血清学试验、酶联免疫吸附试验等，检测细菌对特定抗体的反应性，以确定细菌的免疫学特性。
7. 分子生物学鉴定：应用分子生物学技术，如PCR（聚合酶链反应）、序列分析
等，检测细菌的DNA或RNA序列，以确定细菌的基因特征和亲缘关系。
8. 数据分析和鉴定：根据样品收集、培养、观察、试验等结果，综合分析得到的数据，确定细菌的鉴定结果。
可以参考细菌鉴定手册或数据库，进行对照确认。
这些步骤都需要进行严格的实验操作和分析，以确保细菌鉴定的准确性和可靠性。
不同类型的细菌鉴定流程可能会有所不同，具体流程可以根据实际需要进行调整和优化。
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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。
浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、EB：10 mg/ml。
称取1g溴化乙锭定容至100ml。
棕色瓶室温避光保存。
EB的工作浓度为0.5ug/ml。
当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。
（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。
无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。
25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。
）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备破碎细胞或胞膜—内容物释放核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。
不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备✧用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.✧4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次。
✧将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
✧用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。
✧乙醇沉淀DNA。
✧用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3．◆细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
◆细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
◆菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）。
◆抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。
◆沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。
1 2000rpm离心10。
◆洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
◆抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。
作PCR模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL✧Grow cells overnight in 500 ml broth medium.✧Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50mM EDTA.✧Freeze cell suspension at -20C✧Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, andlet thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.✧Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Placein 50C water bath for 60 min.✧Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.✧Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix byinverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase.Dissolve overnight by rocking at 4C.✧Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.✧Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix byinverting).✧Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA✧Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.5．CTAB/NaCl裂解法⏹接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。
⏹取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。
⏹加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。
⏹加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。
⏹加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
⏹加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。
⏹用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
⏹用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loadingbuffer) , 80 V , 电泳1.5小时。