菌种鉴定流程
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中国药品生物制品鉴定所抗生素室 25
2005年4月16日星期六
3.2 MUG试验原理
2005年4月16日星期六
4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被β -葡糖 苷酸酶（GUD）水解，产生荧光 实验证明96％的大肠杆菌含GUD，约10％的沙门菌属一些 菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6％， 鉴于98％的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基 质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理 论上可使大肠杆菌的检出率达99％ 由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察， 没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临 床、食品、饮水、污水等的检测 MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性 （无荧光）、靛基质阴性（无色） 如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验 不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴 别
中国药品生物制品鉴定所抗生素室 31
2005年4月16日星期六
3.3 MUG与靛基质试验结果判定
如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基 质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻 轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线 于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h， 观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆 菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌 落生长时，供试品分离平板无菌落生长， 或有菌落但不同于下表所列特征，可判为 供试品1g或1ml未检出大肠杆菌
中国药品生物制品鉴定所抗生素室 32
2005年4月16日星期六
大肠杆菌在不同培养基上 菌落形态特征
培养基 菌落形态
典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘 整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非 典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心 紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。 麦康凯琼脂 典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘 整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微 红色，或菌落中心呈红色。
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2005年4月16日星期六
8 自动化仪器
优点：Leabharlann Baidu
包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多， 可以提高菌种鉴定的准确率 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检 验提供保证 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴 定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更 多的选择和便利
中国药品生物制品鉴定所抗生素室 12
2005年4月16日星期六
6 血浆凝固酶试验简介
主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 检测以试管法为参考方法
2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
13
6 凝固酶试验操作方法
无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支 加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液 0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］ 营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对 照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化 钠溶液0.5ml作阴性对照 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次， 直至24h
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22
2
菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用 量为0.1ml）
制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
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中国药品生物制品鉴定所抗生素室
18
B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的 VITEK系统等
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生化鉴定
2005年4月16日星期六
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20
一、大肠杆菌检查法
2005年4月16日星期六
药品微生物限度检查—— 控制菌检查
1
菌种分离鉴定流程
增菌 分纯 初步鉴别试验
革兰染色 生化试验 酶类试验 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴 定） 血清分型 毒素分析 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学， 基因序列等）
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全面鉴定
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3.2 MUG试验操作
以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、 供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液 各0.2ml，分别加入MUG－蛋白胨培养基 （培养基5.7）管，37℃培养4、24h后，将 各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光， 然后加欧波试液4～5滴于上述MUG管内，观 察液面颜色
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21
1
大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆 菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有 蟑螂埃希菌等四个种 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出 体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血 动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健 康，口服药品必须检查大肠杆菌 大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引 起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症
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3.2.2
配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后 pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解， 本身则显荧光 分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白 胨不得显荧光
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3.2.3
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15
6 凝固酶试验的结果判定
阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液 呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应； 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对 照管任何一管不符合要求时，应另制备血 浆，重新试验 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关 制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、 准确性
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2005年4月16日星期六
6 凝固酶试验的注意事项
血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新 鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维 蛋白常已析出)易导致假阴性反应 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜， (动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观 察 试验时间过长容易导致假阴性
2005年4月16日星期六
玻片必须洁净 涂片菌量宜少，菌不可浓 新鲜培养物 脱色是关键
2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
6
3.3 革兰染色意义
3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定 3.3.2 初步选择治疗用药物 3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主， 阴性菌以内毒素为主
2005年4月16日星期六
了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌 落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下 面的试验
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2005年4月16日星期六
3
3.1 操作步骤 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细 胞结构使染料易透过 3.1.2 结晶紫染色-1分 3.1.3 碘液媒染-1分 3.1.4 乙醇脱色-30秒 3.1.5 沙黄复染-30秒
做阳性对照 检查培养基灵敏度
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其用途：
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3
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3.1 增菌培养
取胆盐乳糖（ＢＬ）培养基3瓶，每瓶各 100ml 2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加 入含对照菌50～100个菌落形成单位的控制 菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等 量的稀释剂作阴性对照 37℃培养18～24h（必要时可延至48h）。 阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培 养液
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2005年4月16日星期六
3.2.4
取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性 对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对 照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无 荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观 察比较，或将各管调换位置（阴性管居 中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光 强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察 时，亦可移去阳性对照管
供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时 间，一般在4h、24h观察是否产生荧光，如 荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培 养至48h再观察结果 由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完 全相同，对底物和底物的浓度反应的差异； 培养基中选择因子的影响；培养温度；pH 的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分 的干扰等，对结果的判断亦有影响
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试验阳性图示
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5.3
5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应 不可靠 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出 现假阳性。宜用玻璃棒或木棒 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲 基对苯二胺氧化变色不可用 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过 多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴 性反应 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验， 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性
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3.2 染色结果
革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。 可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 作质控株
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5
3.3 革兰染色注意事项
3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4
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2
参看药典微生物限度检查法
有抑菌活性的检品应进行预处理
稀释法 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先 500r/min离心5min 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇 酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 同时做阳性和阴性对照
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9
5 氧化酶试验
5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新 配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐 渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。 若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应
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7
4 触酶试验
触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面 的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含 有触酶可能导致假阳性出现 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否 利于在有氧环境中生长
细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢， 具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌 氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生 （链球菌，此试验可用于菌种鉴别）
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3.2.1 MUG法不必分离单个菌落
除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙 门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、 杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性 在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可 排除革兰阳性菌的干扰 志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难 生长，即使有生长，本法能检出。并且既 然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检
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7 生化试验
细菌鉴定的传统方法，参考方法 因为针对不同菌种，选择有针对性的 生化试验进行，菌种不同所作的试验 不同，药品检验中常用的种类不再一 一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容 当中单独讨论 所有试验都需要已知阳性和阴性的菌 株作为质控菌株，定期对试剂、培养 基（包括培养基的灵敏度试验）以及 试验操作过程进行质控试验，保证结 果解释的准确性
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3.2 MUG试验原理
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4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被β -葡糖 苷酸酶（GUD）水解，产生荧光 实验证明96％的大肠杆菌含GUD，约10％的沙门菌属一些 菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6％， 鉴于98％的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基 质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理 论上可使大肠杆菌的检出率达99％ 由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察， 没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临 床、食品、饮水、污水等的检测 MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性 （无荧光）、靛基质阴性（无色） 如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验 不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴 别
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3.3 MUG与靛基质试验结果判定
如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基 质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻 轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线 于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h， 观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆 菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌 落生长时，供试品分离平板无菌落生长， 或有菌落但不同于下表所列特征，可判为 供试品1g或1ml未检出大肠杆菌
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大肠杆菌在不同培养基上 菌落形态特征
培养基 菌落形态
典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘 整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非 典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心 紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。 麦康凯琼脂 典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘 整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微 红色，或菌落中心呈红色。
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8 自动化仪器
优点：Leabharlann Baidu
包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多， 可以提高菌种鉴定的准确率 缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检 验提供保证 细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴 定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更 多的选择和便利
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6 血浆凝固酶试验简介
主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定 分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶 检测以试管法为参考方法
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6 凝固酶试验操作方法
无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液(1：1) 各0.5ml，1支 加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液 0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1 支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］ 营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对 照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化 钠溶液0.5ml作阴性对照 三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次， 直至24h
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2
菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］ 对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用 量为0.1ml）
制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至 5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后， 用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106
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B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的 VITEK系统等
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生化鉴定
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一、大肠杆菌检查法
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药品微生物限度检查—— 控制菌检查
1
菌种分离鉴定流程
增菌 分纯 初步鉴别试验
革兰染色 生化试验 酶类试验 抗生素敏感性试验（用于菌种鉴 定） 血清分型 毒素分析 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学， 基因序列等）
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3.2 MUG试验操作
以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、 供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液 各0.2ml，分别加入MUG－蛋白胨培养基 （培养基5.7）管，37℃培养4、24h后，将 各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光， 然后加欧波试液4～5滴于上述MUG管内，观 察液面颜色
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大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichia coli），为肠杆 菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有 蟑螂埃希菌等四个种 大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出 体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血 动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健 康，口服药品必须检查大肠杆菌 大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒 性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引 起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症
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3.2.2
配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后 pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解， 本身则显荧光 分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白 胨不得显荧光
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3.2.3
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15
6 凝固酶试验的结果判定
阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液 呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应； 不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对 照管任何一管不符合要求时，应另制备血 浆，重新试验 目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关 制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、 准确性
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6 凝固酶试验的注意事项
血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新 鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维 蛋白常已析出)易导致假阴性反应 用试管法检查时，轻轻将试管倾斜， (动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观 察 试验时间过长容易导致假阴性
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玻片必须洁净 涂片菌量宜少，菌不可浓 新鲜培养物 脱色是关键
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3.3 革兰染色意义
3.3.1 初步识别细菌，利于进一步鉴定 3.3.2 初步选择治疗用药物 3.3.3 与致病性相关，阳性以外毒素为主， 阴性菌以内毒素为主
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了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌 落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下 面的试验
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3.1 操作步骤 3.1.1 制片-过火固定，避免水冲，破坏细 胞结构使染料易透过 3.1.2 结晶紫染色-1分 3.1.3 碘液媒染-1分 3.1.4 乙醇脱色-30秒 3.1.5 沙黄复染-30秒
做阳性对照 检查培养基灵敏度
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其用途：
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3.1 增菌培养
取胆盐乳糖（ＢＬ）培养基3瓶，每瓶各 100ml 2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加 入含对照菌50～100个菌落形成单位的控制 菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等 量的稀释剂作阴性对照 37℃培养18～24h（必要时可延至48h）。 阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培 养液
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3.2.4
取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性 对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对 照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无 荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观 察比较，或将各管调换位置（阴性管居 中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光 强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察 时，亦可移去阳性对照管
供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时 间，一般在4h、24h观察是否产生荧光，如 荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培 养至48h再观察结果 由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完 全相同，对底物和底物的浓度反应的差异； 培养基中选择因子的影响；培养温度；pH 的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分 的干扰等，对结果的判断亦有影响
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试验阳性图示
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5.3
5.3.1 试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应 不可靠 5.3.2 试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出 现假阳性。宜用玻璃棒或木棒 5.3.3 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲 基对苯二胺氧化变色不可用 5.3.4 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过 多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴 性反应 5.3.5 含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验， 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性
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3.2 染色结果
革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。 可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 作质控株
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3.3 革兰染色注意事项
3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4
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参看药典微生物限度检查法
有抑菌活性的检品应进行预处理
稀释法 离心沉淀集菌法 3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先 500r/min离心5min 薄膜过滤法 0.45um± 0.02 100ml 中和法 磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇 酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80 自然沉降法 难溶于水的抗菌制剂 同时做阳性和阴性对照
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5 氧化酶试验
5.1 试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新 配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液 5.2 结果判定：30s，培养物出现粉红色逐 渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。 若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应
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4 触酶试验
触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面 的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含 有触酶可能导致假阳性出现 用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否 利于在有氧环境中生长
细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢， 具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌 氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生 （链球菌，此试验可用于菌种鉴别）
2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
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3.2.1 MUG法不必分离单个菌落
除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙 门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、 杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性 在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可 排除革兰阳性菌的干扰 志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难 生长，即使有生长，本法能检出。并且既 然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检
2005年4月16日星期六
中国药品生物制品鉴定所抗生素室
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7 生化试验
细菌鉴定的传统方法，参考方法 因为针对不同菌种，选择有针对性的 生化试验进行，菌种不同所作的试验 不同，药品检验中常用的种类不再一 一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容 当中单独讨论 所有试验都需要已知阳性和阴性的菌 株作为质控菌株，定期对试剂、培养 基（包括培养基的灵敏度试验）以及 试验操作过程进行质控试验，保证结 果解释的准确性