微生物菌种分离和鉴定技术

土壤微生物的分离纯化与鉴定

土壤微生物的分离纯化 与鉴定 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

目录

摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。 关键词 土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养 前言 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。 实验目的 1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的 方法； 2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法； 3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法； 4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室 培养法观察鉴定未知真菌。

实验原理 一、经典分类鉴定方法 以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。 二、现代分类鉴定方法 1．微生物遗传型的鉴定 （1） DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素： *解链温度法（Tm值） *(G+C)mol%值只能做否定判断； *（G+C）mol%值差别>5，属不同的种； 差别>10，属不同的属。 （2）核酸分子杂交法 *DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专 一性。 结论： I DNA同源性≥ 60% （同种） II DNA同源性≥ 70% （同亚种） III DNA同源性60~ 70% （不同亚种） IV DNA同源性20~ 60% （同属） （3）16s rRNA作为细菌进化的计时器 本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。 实验整体思路： 在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数； 通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；

双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基

BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。

亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备

微生物菌种的分离和纯化方法

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，

中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特性菌株的筛选

中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特 性菌株的筛选 本研究采用选择性培养基对河南、四川、西藏、云南、内蒙古和新疆等地区的18份人体粪便样品中的双歧杆菌进行了分离纯化,并采用16S rRNA基因序列分析法对分离到的29株双歧杆菌进行了鉴定。以B.animalis subsp.Iactis V9为参照,通过耐酸性、人工消化液和胆盐耐受试验,筛选出胃肠道转运过程中耐受性较好的4株双歧杆菌。 并对筛选出的双歧杆菌进行了脱脂乳发酵特性和贮藏特性的研究。试验结果表明,从18位中国部分地区健康人体粪便中分离得到29株双歧杆菌,经16S rRNA 基因序列分析法将IMAUFB064、IMAUFB065和IMAUFB091等9株菌鉴定为B. longum,其中河南6株、四川2株和新疆1株；将IMAUFB071、IMAUFB073、IMAUFB084、IMAUFB090和IMAUFB092等20株菌鉴定为B.pseudocatenulatum,其中四川9株、西藏7株、云南3株和内蒙古1株。 29株双歧杆菌中有24株在pH3.0、3.5和4.0的改良MRS培养液中生长良好,初筛出的24株双歧杆菌分别经pH3.0、2.5、2.0人工胃液消化3h后,存活率高于V9(84.97%)的菌株有2株,分别为IMAUFB084(85.98%)和MAUFB073(85.66%),占总菌数的6.90%,各菌株在不同pH值人工胃液中耐受性有显著差异 (P<0.05),随着pH值的降低,供试菌株对模拟人工胃液的耐受性也随之降低。4株复筛出的双歧杆菌在人工肠液消化8h后,其中MAUFB090的存活率为101.8%,高于V9(97.84%),MAUFB073(97.19%)、IMAUFB084(94.38%)和IMAUFB064(89.93%)都低于V9的存活率。 4株双歧杆菌均能耐受2.0%胆盐浓度,但各菌株的延迟时间差异显著

微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告 学院：生命科学学院 班级： 2013级生科2班 组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079

郑国梁 2013506083 2015年10月15日 一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。 二、实验原理 土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特

殊培养基的方法，来获得放线菌。

放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。 三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4

实验方案(双歧杆菌的分离)

1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml 葡萄糖10g 溶液C 50ml 乳糖3g 琼脂 15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，

植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。 溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。 1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。

微生物菌种的分离和纯化方法

在从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。 不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特分子生物学的研究及应用中，防止其他微生物的混入。定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”， 、用固体培养基分离和纯化1 有繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、便成称为菌落。一定形态结构的子细胞生长群体，当固体培养基表面众多菌落连成一片时，可以成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，以及许多真菌和单细胞藻鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、为对该微生物进行分类、所谓平板，类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。固体培养基用琼脂或其它凝这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。建立的采用Kock最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100 稀释倒平板法1.1 ），然后分别取不、1:100001:1000首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培同稀释液少许，与已熔化并冷却至如果养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。这个菌落可能就是由一个在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，稀释得当，细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。涂布平板法1.2 且采用稀释因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，因此在微生物倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，再用无菌玻璃涂棒将将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，制成无菌平板，冷却凝固后，）。菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1供参 考． 涂布平板法1 图平板划线法1.3 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，），微

模板土壤微生物的分离培养技术实验报告.doc

重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制

一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。

微生物学实验报告——双歧杆菌分离

微生物学实验报告 乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化 2012/6/5 实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。 实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。 因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。 本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 实验方法： 1.培养基 双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】 枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】 2.简易厌氧罐法 将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。 图1. 实验中使用的简易厌氧罐

实验二微生物的分离、纯化和接种

实验二微生物的分离、纯化和接种 微生物的分离、纯化 1、目的要求 1.1了解微生物分离和纯化的原理 1.2掌握常用的纯化分离微生物的方法 2、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、pH值、温度和溶解氧等要求，或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。而纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 本实验将在混合有几种微生物菌液中分离纯化出两种微生物来。 3、实验材料 3.1培养基 肉汤培养基（固体）。

3.2溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，其中有一只盛有玻璃珠。 3.3仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，涂布器等。 4流程 倒平板制备梯度稀释液涂布（或划线法）培养挑单菌落保存。 5、步骤 5.1平板划线分离法 5.1.1倒平板 倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后置于桌面上，待凝固后即成平板(教材p367图13-14)。并用记号笔标明培养基名称、菌液编号和试验日期。 5.1.2划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取菌悬液一环在平板上划线(教材p367图13-15)。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。

土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定

吉林化工学院 科技性论文 题目：土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的 测定 学号：12130117 姓名：张金磊 年级：2012级 学院：化工与生物技术学院 专业：生物工程 指导教师：谢莹，许崇利（讲师） 完成日期：2014年3月20 日

摘要 土壤是矿物质、有机质和活的有机体以及水分和空气等的混合体。按重量计，矿物质占到固相部分（土壤干重）的90~95%或更多，有机质约占1~10%，可见土壤成分以矿物质为主。土壤有机质就是土壤中以各种形态存在的有机化合物。除此之外还有土壤溶液，它是土壤水分及其所含的溶解物质和悬浮物质的总称。土壤溶液是植物和微生物从土壤中吸收营养物的媒介。土壤微生物就是土壤中主要的有机生命体，土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。 本次实验是研究土壤中细菌、真菌、放线菌的数目。我们利用选择培养基，以便在土壤水溶液中选出目的菌种，在用分浓度梯度法在选择培养基上培养出但菌落，以便计数。计数时可以根据不同菌种的不同形态学特征来分辨，如果出现与上述三种以外特性的菌种可以用革兰氏染色鉴别。 关键词：土壤微生物选择培养计数

Abstract Soil is a mixture of minerals, organic matter and living organisms as well as water and air. By weight, for solid mineral (soil dry weight) of 90~95% or more, organic matter accounted for about 1~10%, visible in mineral soil composition. Organic compounds in soil organic matter is the soil in various forms. In addition to the soil solution, it is the floorboard of soil moisture and the contained dissolved substances and suspended substances. Soil solution is to absorb the nutrients in plants and microorganisms in soil medium. Organic life is the main soil microorganism, soil microbial refers to live in soil bacteria, fungi, actinomycetes, algae. The individual small, general with micron or nanometer to calculate, usually 1 grams of soil in 106 ~ 109, its species and quantity as soil environment and soil depth varies. They are oxidation, nitration, ammoniation, nitrogen fixation, curing process in the soil, promote the transformation of soil organic matter decomposition and nutrient. This experiment is to study the number of soil bacteria, fungi, actinomycetes. We use the selective culture medium, in order to choose to bacteria in the soil solution in the culture medium, but colonies on selection by density gradient method,

食品中双歧杆菌检验方法

食品中双歧杆菌检验方法 环凯针对目前乳制品行业及质量监测单位检验双歧杆菌的需求及情况，对双歧杆菌检验相应的培养基进行了改进，使得双歧杆菌检出率较之前有很大的改进。扩充并完善了相关的微生物检测试剂，使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。 环凯依据GB 4789.34-2012食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验，推出成套的双歧杆菌检验解决方案，为生产企业及检验单位提供方便。 图1：GB 4789.34-2012双歧杆菌检验流程图 表1：实验操作所用培养基及生化试剂 功能阶段实 验 序 产品序 号 产品名称规格类别

号 稀释液1 CP0630 生理盐水 225mL× 10袋 盒（袋装） 平板分离2 027330 双歧杆菌琼脂培养基（BBL 琼脂培养基） 250g 瓶（干粉） 生理生化 3 029010 革兰氏染色液 10mL×4 支 盒 4 029161 过氧化氢酶试剂 2mL×10 支 盒（西林 瓶） 5 027340 PYG液体培养基基础250g 瓶（干粉）SR0300 PYG液体培养基配套试剂 （A、B各一支添加于100 ml 基础培养基中） 2种×5支 /盒 盒（西林 瓶） 6 027350 TPY液体培养基250g 瓶（干粉） 7 029010 革兰氏染色液 10mL×4 支 盒 8 029080 甘油 2mL×10 支 盒（西林 瓶） 9 075060 D-阿拉伯糖20支 盒（西林 瓶） 10 075400 D-核糖20支 盒（西林 瓶） 11 075070 D-木糖20支 盒（西林 瓶） 12 075080 D-半乳糖20支 盒（西林 瓶） 13 075010 D-葡萄糖20支 盒（西林 瓶） 14 075550 D-果糖20支 盒（西林 瓶） 15 075380 D-甘露糖20支 盒（西林 瓶） 16 075110 L-鼠李糖20支 盒（西林 瓶） 17 075100 卫矛醇20支 盒（西林 瓶） 18 075120 肌醇20支 盒（西林 瓶）

土壤微生物的分离鉴定

土壤微生物的分离鉴定 实验报告 09级生科一班（周一下午组） 安明玉 同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶 一、实验摘要 利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。 二、实验目的 1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2.巩固练习显微镜使用方法。 3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。 4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。 5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。 6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。 三、实验原理 1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。 本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面： (1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； (2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。 但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。 2. 显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。 在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。 与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做

土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。

肠道微生物的分离与鉴定方法

一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地衣）。5种 有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。4种 二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。5种 需氧菌：芽孢杆菌。1种 兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。2种 注： 境中生长最好。最适温度为37～42℃。在正常大气或无氧环境中均不能生长。 肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。 三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。 需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。 四、无氧环境的简易操作： 1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》 采用干燥器培养，1m3空间用焦性没食子酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸

包好，放在圆柱上。继而放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。盖上缸盖并用石蜡封闭。再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。置于温箱37℃培养24一48h观察结果。 2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》 后者先拧紧瓶盖,放入密封性较好的玻璃罐(用凡士林封口)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。 五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱 厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须小于1000ppm（千分之一），更严格的环境是小于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。（1ppm即百万分之一）。 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术； 1.一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。

不同水体中微生物的分离与鉴定

环境微生物 综合性实验实验报告 班级： 组员： 指导教师： 学年：2012 –2013 日期：2013-03-29

不同水体中微生物的分离与鉴定 摘要水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含一定数量的微生物。不同的水体由于受到物理、化学、生物等各个方面因素的影响,使其中所含微生物的种类和数量不同。本实验通过对雨水和湖泊水中微生物的培养、分离与鉴定，了解自然界中的不同水体中存在的微生物的种类和数量，比较两种水体中微生物群落的分布特点，进一步了解不同水体的清洁程度。 关键词微生物雨水鱼塘水种群 SOLATION AND IDENTIFICATION OF DIFFERENT MICRO-ORGANISMS IN WATER Abstract Water is the microorganism widely distributed natural environment. A variety of natural water often contains a number of micro-organisms. Different bodies of water due to the influence of the physical, chemical, biological and other factors, including the type and quantity of microorganisms contained in different. In this study, rain and lake water microbial cultivation, isolation and identification, understanding the distribution characteristics of the microbial community of the types and quantities of the different bodies of water in the nature of the micro-organisms, compare the two water bodies to learn more about the cleanliness of the different water bodies. Key words Microbial Rainwater Fish pond water Populations

双歧杆菌的分离培养及鉴定

厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。 双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。 双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。 目前，双歧杆菌鉴定的方法有很多种。近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD 技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。 实验用具 高纯氮气厌氧管注射器培养箱冰块水浴锅镊子记号笔 MRS培养基细菌生化微量鉴定管酒精棉球瓷盘振荡器铜柱除氧系统定量加样器 恒温水浴载玻片显微镜恒温培养箱超声波破碎仪滤纸层析缸酒精灯封口膜厌氧罐等。 实验方法与步骤 1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 2预还原培养基及稀释液的制备