第五章 工业微生物产生菌的分离筛选
工业微生物产生菌的分离筛选(二)
工业微生物产生菌的分离筛选（二）富集（enrichment）培育是在目的微生物含量较少时,依据微生物的生理特点,设计一种选择性培育基,制造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下快速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分别到所需要的菌株.富集培育主要依据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以掌握.一般可从以下几个方面来进行富集.一、掌握培育基的养分成分微生物的代谢类型非常丰富,其分布状态随环境条件的不同而异.假如环境中含有较多某种物质,则其中能分解利用该物质的微生物也较多.因此,在分别该类菌株之前,可在增殖培育基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源.那些能分解利用的菌株因得到充分的养分而快速繁殖,其他微生物则由于不能分解这些物质,生长受到抑制.当然,能在该种培育基上生长的微生物并非单一菌株,而是养分类型相同的微生物群.富集培育基的选择性只是相对的,它只是微生物分别中的一个步骤.现举两例,如要分别水解酶产生菌,可在富集培育基中以相应底物为惟一碳源,加入含菌样品,给目的微生物以最佳的培育条件（pH、温度、养分、通气等）进行培育.能分解利用该底物的菌类得以繁殖,而其他微生物则因得不到碳源无法生长,菌数渐渐削减.此时分别将得到所需的微生物.又如要分别耐高渗酵母菌,由于该类菌在一般样品中含量很少,富集培育基和培育条件必需严密设计.首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样.富集培育基为5%～6%的麦牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃温度下进行培育,可以达到富集的目的.在富集培育时,还需依据微生物的不同种类选用相应的富集培育基,如淀粉琼脂培育基通常用于丝状真菌的增殖,配方为（%）：可溶性淀粉4,酵母浸膏0.5,琼脂2,pH6.5～7.0.在配制时要特殊留意酵母浸膏加量,过多会刺激菌丝生长,而不利于孢子的产生.依据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点,可通过连续富集培育的方法分别降解高浓度污染物的环保菌.如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培育,待底物完全降解后,再以肯定接种量转接到新奇的含苯胺的富集培育液中,如此连续移接培育数次.同时将苯胺浓度逐步提高,便可得到降解苯胺占优势的菌株培育液,采纳稀释涂布法或平板划线法进一步分别,即可得到能降解高浓度苯胺的微生物.移种的时间既可依据底物的降解状况,也可通过微生物的生长状况确定.如在分别环己烷降解菌时,样品经环己烷为惟一碳源的培育基富集后,培育液由原来的无色变为浑浊的乳白色.同时锥行瓶壁上也可观看到微生物的生长状况.此时可以2%的接种量移入新奇的富集培育基中连续培育.连续富集培育的方法虽耗时较长,有时甚至需要6～7个月,但效果较好.通过该方法分别DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌,也都取得了满足的结果.二、掌握培育条件在筛选某些微生物时,除通过培育基养分成分的选择外,还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特别要求加以掌握培育,达到有效的分别目的.如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）.因此,富集培育基的pH值调整到被分别微生物的要求范围不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.分别放线菌时,可将样品液在40℃恒温预处理20分钟,有利于孢子的萌发,可以较大的增加放线菌数目,达到富集的目的.筛选极端微生物时,需针对其特别的生理特性,设计相宜的培育条件,达到富集的目的.一般所筛选的微生物通常是好氧菌,但有时也需分别厌氧菌.因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置,还可节约能耗.这时除了配置特别的培育基外,还需预备特别的培育装置,制造一个有利于厌氧菌的生长环境,使其数量增加,易于分别.三、抑制不需要的菌类在分别筛选的过程中,除了通过掌握养分和培育条件,增加富集微生物的数量以有利于分别外,还可通过高温、高压、加入抗生素等方法削减非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加,同样能够达到富集的目的.从土壤中分别芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡.可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,杀死不产芽孢的菌种后再进行分别.在富集培育基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长,对革兰阴性无抑制作.分别厌氧菌时,可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂,它能使培育基氧化还原电势下降,造成缺氧环境,有利于厌氧菌的生长繁殖.筛选霉菌时,可在培育基中加入四环素等抗生素抑制细菌,使霉菌在样品的比例提高,从中便于分别到所需的菌株；分别放线菌时,在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml,以及丙酸钠10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长.另外据报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,也可用于选择分别放线菌.在分别除链霉菌以外的放线菌时,先将土样在空气中干燥,再加热到100℃保温1h,可削减细菌和链霉菌的数量.分别耐高浓度酒精和高渗酵母菌时,可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间,杀死非目的微生物后再进行分别.对于含菌数量较少的样品或分别一些稀有微生物时,采纳富集培育以提高分别工作效率是非常必要的.但是假如按通常分别方法,在培育基平板上能消失足够数量的目的微生物,则不必进行富集培育,直接分别、纯化即可.。
工业微生物产生菌的分离筛选(四)
工业微生物产生菌的分离筛选（四）各种微生物对养分要求和培育条件是不同的,在分别筛选时若在这两个方面加以调整掌握,就能获得更好的分别效果.1. 培育基的养分成分各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对养分还有特别的要求,事先了解被分别微生物的养分要求,从而设计一个合理快速的分别培育基,能够收到事半功倍的效果.放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源.在选择分别放线菌时,通常采纳改良的HV琼脂培育基、土豆-胡萝卜水汁液培育基和淀粉琼脂培育基能取得较好的效果.但不同菌种对养分要求差别很大,如奴卡氏菌在有氧条件下用一般培育基即可分别到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有相宜培育基的状况下才能正常生长繁殖.筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分别,如以淀粉为碳源的培育基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分别培育基,可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培育基,可以鉴别蛋白酶的产生菌.纯种分别时,把以上琼脂平板置于相宜的温度培育肯定的时间,如具有产生水解酶力量的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,依据圈的大小可初步推断酶活力强弱.测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选.2. 培育基的pH细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分别培育基的pH应当调整到被分别微生物要求范围.这不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.例如,分别柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调整培育基的酸碱度获得胜利的.其分别方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸 10%～20%配成培育液,调整pH2.0～2.5,以肯定量的培育基和土样匀称混合,用毛细吸管点种在平皿内事先掩盖的无菌滤纸上（2～3层）,于30℃培育,这样可以分别到产生柠檬酸的黑曲霉.分别碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培育基调到pH9～11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分别本身起到浓缩作用.大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产酶pH相同.培育基的pH要结合养分成分和培育条件来考虑.由于微生物在生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制.一般培育基中碳氮比（C/N）高者,培育后倾向于酸性,反之则倾向于碱性.无机盐的性质也会影响pH变化,（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42-,培育液变成酸性.而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3-被菌体分解利用后,剩余Na+,使培育液变成碱性.如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降.为了维持培育基的PH,一般要加磷酸盐,如K2HPO4、KH2PO4,使培育基具有肯定的缓冲力量.假如培育液中的酸碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调整pH变化,则可适当加入碳酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培育基的pH能保持在恒定的范围内.此外,在分别霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持肯定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长.3. 排解不需要的菌类实行调整pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到肯定的作用,但并不是对全部的菌类都有效.有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培育基中生长.为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂.（1）分别细菌时,在培育基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长.（2）分别放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长.（3）分别霉菌和酵母菌时,在培育基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长.（4）分别根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易扩散成片,难以得到纯化的菌落,通常在培育基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝扩散,使菌落长得小而紧密.一般用于分别单一目的微生物的培育基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型试验室配制较麻烦,现已有成品供应,只要直接加入基础培育基即可.如氨苄西林,主要用于分别亲水气单孢菌.4. 掌握培育温度掌握培育温度,也是一种获得目的微生物的有效措施.各类微生物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类：一类是高温微生物,最适温度在50～60℃.假如要分别这类菌可将分别培育基置于50～60℃温度下培育,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分别到高温菌类.其次类是中温微生物,它们的最适生长温度是20～40℃,超过50℃,就停止生长.这类微生物最为常见,、数量都占首位.工业发酵微生物绝大多数都属于此类.其中不同类群微生物对温度又有所差别,一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃,霉菌和酵母最适温度为20～28℃.第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低.当从样品中分别各种菌类时,分别置于自身最适温度下培育也可大体上抑制另一些微生物的生长.当分别某些特别产物的微生物时,对温度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分别效果最好.。
工业微生物产生菌的分离筛选【3】
工业微生物产生菌的分离筛选【3】在分离以氯化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到分解氰化物的菌株。
由于塑料工业的发展，环境中到处都有各种高分子包装废弃物，这些污染物多为不溶于水的高分子化合物，获得其降解菌株较为困难。
通常采用富集法进行筛选，如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化，分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。
在淀粉塑料的降解试验中，采用加富土壤淹埋法，筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。
这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。
尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀，由于聚乙烯的流动性好，因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使细菌在初期很难降解这类共混物，所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。
除驯化培养进行降解菌的筛选外，还可采用阶段式筛选法。
如在分离聚乙二醇降解菌时，可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物，再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株，也能达到较好的效果。
除寻找能够降解废旧塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。
目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。
有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺，将淀粉填充到聚乙烯等树脂内，淀粉可以被微生物分解，但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了，反而为废弃塑料的回收增加了困难。
而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯（PHB）相类似的结构，无毒，且能在酸、碱和微生物条件下完全降解，同时具有良好的塑性，用途宽广的多。
用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成为研究生物降解塑料的热点，其中利用真氧产碱杆菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。
PPT 工业微生物的分离与筛选.
液体培养基常用组分表
放线菌
细菌
霉菌
植物病原菌
碳源：葡萄糖、淀粉、 葡萄糖、柠檬 乳糖、葡萄 葡萄糖、蔗糖
糊精、蔗糖、麦芽糖 酸钠
糖、蔗糖
氮源：大豆粉、蛋白 肉汤、蛋白胨、玉米浆、蛋 蛋白胨
胨、牛肉膏、玉米浆、 豆饼粉、酵母 白胨
取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类
要求：熟练的操作技术
第四节 有用微生物的筛选
筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。 筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特定的
操作程序分离并发现有用的微生物。
一 供筛选分离样品（采样）的来源 二 初筛 三 复筛 四 抗菌谱的测定
一 供筛选分离样品（采样）的来源
诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、 糖多孢菌。不易形成孢子。少见。
常规培养基不能分离。需对不同来 源的样品做预处理。
如分离游动放线菌：
将混浊土壤水样倾入培养皿 中，后接入花粉进行培养。或采 用加温处理。
链霉菌
放线菌产生的主要抗生素 稀有放线菌
氨基糖苷类 氯霉素 链霉素 环丝氨酸 林可霉素 新生霉素
小单胞菌
1 自然资源分离筛选
土壤采样分离。
最理想是山野、农田、沼泽、湖泊、海洋
考虑不同民俗、动植物生态。
2 已有菌株
包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。
二 初筛
初筛 一次或多次从现有菌群中把多数无用的 微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选 出来。
（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。
（二） 要求：
快速——有预测或预见 敏捷——迅速处理好众多的样品。 经济——得到有广泛目标的有用微生物。
工业微生物的分离与筛选ppt课件
诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、 糖多孢菌。不易形成孢子。少见。
常规培养基不能分离。需对不同来 源的样品做预处理。 如分离游动放线菌： 将混浊土壤水样倾入培养皿 中，后接入花粉进行培养。或采 用加温处理。
放线菌产生的主要抗生素 链霉菌 小单胞菌
氨基糖苷类
有用微生物必须具备的特性
无 1 菌株应为“纯种培养”。镜检无其它微生物。且 噬菌体感染。 2 菌种具稳定的遗传性。 3 必须能生长出可再生的单位——营养细胞 孢子 4 种子质量好——各级种子罐的扩大培养要生长迅 速、强健。
有用微生物必须具备的特性
5 在短时间内可获得目的产物——3天或更短。 6 菌株的自我保护及采取措施——降低PH 高温生长 加入选择性抑制剂。 7 目的产物多，且在多组分中易分离。
养时要加盖。以防污染。
（3）接种用具（吸管、接种环）要灭菌 （4）接种时塞子或盖要在火焰上过一下。
2 采样分离方法
（1）从自然界采样分离 挖土 稀释 接种 培养分离 —— 表面向下5cm，编号记录 —— 1000～100万倍 —— 取0.1～0.2ml稀释液 —— 选用易生长发育的培养基
2 采样分离方法
◆3 应用 开采石油：嗜压菌产气增压降低原油粘度。 生产特殊酶制剂：嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗
涤剂的添加剂
环境保护：嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解
木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物
遗传工程以及基因技术：从水生栖热菌中提取耐
热的Taq DNA聚合酶
第二节 产生抗生素菌株的来源
产生抗生素的菌株主要来源于土壤，可在不同 的环境（高山、平原、河川、深海、旱地）采集 挖掘样品分离筛选。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。
其中生产菌种得性能就是最重要得因素。
(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(２)从大自然中采集样品分离;(3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。
(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(１)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。
采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。
工业微生物菌种的选育、保藏与培养
工业微生物菌种的选育、保藏与培养自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。
菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。
菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。
菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。
筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。
微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。
因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。
菌种收集和筛选途径：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。
该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料筛选↓↓设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓采样复筛（1株3～5瓶）↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定一、菌种的分离筛选一）样品采集与预处理总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
菌种的筛选和分离
工业微生物菌种的分别与筛选起源：青岛海博一.微生物工业对菌种的请求(一).微生物工业的临盆程度由三个要素决议：临盆菌种的机能.发酵及提纯工艺前提.临盆装备.个中临盆菌种的机能是最重要的身分.（二）.微生物工业对菌种的请求是：（1）菌株高产,在较短的时光内发酵产生大量发酵产品的才能;（2）在发酵进程中不产生或少产生与目标产品邻近的副产品及其他产品;（3）发展滋生才能强,较强的发展速度,产孢子的菌种应当具有较强的产孢子才能;（4）可以或许高效地将道理转化为产品;（5）能应用普遍的原材料,并对发酵原料成分的摇动迟钝性小;（6）对须要添加的前体物质有耐受才能,并且不克不及将这些前体物质作为一般碳源应用; （7）在发酵进程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的才能;（9）遗传稳固性,二.工业用微生物菌种的起源及选育（一）微生物菌种的起源一般经由过程以下几个门路收集菌种.收集样品和分别筛选：（1）是依据材料直接向有科研单位.高级院校.工场或菌种珍藏部分索取或购置;（2）从大天然中收集样品分别;（3）从一些发酵成品平分别筛选目标菌株.当前发酵工业所用菌种总趋向是从野生菌转向变异菌,天然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种.（二）微生物工业菌种的分别1.野生菌株的分别.筛选进程（1）新菌种分别与筛选的步调菌种分别的流程如下：标本收集→标本材料的预处理→富集造就→菌种初筛→菌种复筛→机能判定→菌种珍藏①采样采样季候：以温度适中,雨量不久不多的秋初为好.采土方法：在选好恰当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入干净的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标识表记标帜,记载采样时光.地点.情形前提等,以备查考.为了使土样中微生物的数目和类型尽少变更,宜将样品慢慢分批寄回,以便实时分别.②标本预处理④纯种分别：采取划线分别法.稀释分别法等纯化办法获取单菌落.⑤高产菌株的筛选：这一步是采取与临盆邻近的造就基和造就前提,经由过程三角瓶的容量进行小型发酵实验,获得合适于工业临盆用菌种.还要对菌种进行发酵机能测定,⑥毒性实验：据有的国度划定,微生物中除啤酒酵母.脆壁酵母.黑曲霉.米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性实验外,其他微生物作为食用,均需经由过程两年以上的毒性实验.2.菌种的分别办法（1）施加选择性压力分别法主如果应用不合种类的微生物其发展滋生对情形和养分的请求不合,如温度.pH.渗入渗出压.氧气.碳源.氮源等,工资控制这些前提,使之利于某类或某种微生物发展,而晦气于其他种类微生物的生计,以达到使目标菌种占优势．而得以快速分别纯化的目标.如可以控制造就时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物离开;经由过程控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物离开;控制pH,可将嗜酸.嗜碱微生物分别等.在分别造就基中也可以参加不合的抗生素或试剂来增长选择性.如在分别放线菌和细菌时,可参加抗真菌抗生素;分别真菌时,可参加抗细菌药物.（2）随机分别办法有些微生物的产品对筛选没有直接的选择性指导感化,是以常采取随机分别办法分别.A.抗生素产生菌的分别抗生素产生菌的分别经常应用抑菌圈法.实验必须用对象菌：采取抗生素的迟钝菌,传统上经常应用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌.Ｂ.抗肿瘤药物产生菌的分别抗肿瘤药物产生菌的分别经常应用办法：生化引诱法.SOS生色检测法.DNA修复才能突变株.道理是应用DNA的毁伤,微生物产生突变.B1.生化引诱法：将大肠杆菌的lacZ基因衔接在λ噬菌体的PL启动子下,当DNA毁伤时,诱发λ隔绝物CI分化,PL启动子启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的消失.B2.SOS生色检测法：应用当DNA毁伤时,可活化yecA蛋白,进而分化噬菌体的隔绝蛋白,再引起sifA基因启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的消失.Ｃ.发展因子产生菌的分别以氨基酸产生菌为例,介绍筛选办法.起首将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分别造就基中发展,然后采取影印法,将菌落复印到能支撑氨基酸产生菌发展的造就基中,造就2-3天后,用紫外线杀司长好的菌落,再往此平板上面铺一层响应养分缺点型菌株菌悬液,造就16小时后,被杀逝世的氨基酸产生菌的菌落四周应有一检测菌的发展圈.（3）目标微生物分别A.依据形态筛选突变株B.依据平板菌落生化反响筛选变株透明圈法.呈色圈法.抑菌圈法.污浊圈法等.①透明圈法：在平板造就基中参加消融性较差的底物,使造就基混浊.能分化底物的微生物便会在菌落四周产生透明圈,圈的大小初步反响该菌株应用底物的才能.该法在分别水解酶产生菌时采取较多,如脂肪酶.淀粉酶.蛋白酶.核酸酶产生菌都邑在含有底物的选择性造就基平板上形成肉眼可见的透明圈.在分别某种产生有机酸的菌株时,也平日采取透明圈法进行初筛.在选择性造就基中参加碳酸钙,使平板成混状,将样品悬浮液涂抹到平板长进行造就,因为产生菌可以或许把菌落四周的碳酸钙水解,形成清楚的透明圈,可以随意马虎地辨别出来.分别乳酸产生菌时,因为乳酸是一种较强的有机酸,是以,在造就基中参加的碳酸钙不但有辨别感化,还有酸中和感化.②变色圈法：对于一些不轻易产生透明圈产品的产生菌,可在底物平板中参加指导剂或显色剂,使所需微生物能被快速辨别出来.如筛选果胶酶产生菌时,用含0.2%果胶为惟一碳源的造就基平板,对含微生物样品进行分别,待菌落长成后,参加0.2%刚果红溶液染色4h,具有分化果胶才能的菌落四周便会消失绛红色水解圈.在分别谷氨酸产生菌时,可在造就基中参加溴百里酚蓝,它是一种酸碱指导剂,变色规模在pH6.2～7.6,当pH在6.2以下时为黄色,pH7.6以上为蓝色.若平板上消失产酸菌,其菌落四周会变成黄色,可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌.③发展圈法：发展圈法通经常应用于分别筛选氨基酸.核苷酸和维生素的产生菌.对象菌是一些相对应的养分缺点型菌株.将待检菌涂布于含高浓度的对象菌并缺乏所需养分物的平板长进行造就,若某菌株能合成平板所需的养分物,在该菌株的菌落四周便会形成一个混浊的发展圈.如嘌呤养分缺点型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混淆倒平板,在其上涂布含菌样品保温造就,四周消失发展圈的菌落即为嘌呤产生菌.④抑菌圈法：经常应用于抗生素产生菌的分别筛选,对象菌采取抗生素的迟钝菌.若被检菌能排泄某些克制菌发展的物质,如抗生素等,便会在该菌落四周形成对象菌不克不及发展的抑菌圈,很轻易被辨别出来.实验十从天然界平分别筛选微生物菌种1 目标（1）进修并控制优秀曲霉菌的分别道理和办法.（2）进修工控制酸乳中乳酸菌的分别道理和办法.2 道理从天然界平分别筛选微生物菌种,是我们获得优秀新菌种最根本.最重要的办法,是以,食物工业菌种的分别筛选是一项重要的.长期而沉重的工作.天然界消失着各类各样的微生物,尤其是泥土中微生物种类齐备,是微生物的大本营.是以可以从泥土平分别到几乎所有微生物.别的,不合的天然界情形中生计的微生物优势菌种也不合.各类食物.农副产品等养分构成不合,从中可以分别出不合的微生物.食物工业菌种经常应用的分别源有被污染的临盆或科研菌种.临盆中长期应用的菌种.发酵食物用菌种.动物肠道菌群.经各类育种办法处理过的微生物质料和天然界菌种样品.天然界的微生物是混淆生计的,要从平分理出一种微生物,不但须要斟酌分别源应含有较多半量的目标菌,还要在分别操纵中使之与其他菌种互相离开.对于样品中含量较低的菌处,要针对其生物学特色合理设计分别办法,如富集造就.选择造就.应用其特别的心理反响产生特定的发展现象等,以便于从大量杂菌中选出目标菌种.从混淆群体平分别特定微生物的经常应用办法有：控制分别造就基的养分成分.控制造就基的pH值.添加克制剂.控制造就温度.控制空气前提.对样品进行特别处理等.经常应用的纯种分别办法有平板划线分别法.简略平板分别法.稀释分别.涂布分别法.毛细管分别法.显微操纵单细胞分别法等.本实验将采取稀释法和涂布法对目标微生物进行分别筛选.优秀曲霉菌的分别采取透明圈法,即先用淀粉琼脂造就基造就样品,因为糖化酶的感化,长出的菌落四周的淀粉被水解,遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色.一般来讲,透明圈的直径越大,该菌的糖化力越强.可依据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株.酸乳中乳酸菌的分别采取溴甲酚绿（BCG）牛乳养分琼脂平板分别法.溴甲酚绿指导剂在酸性情形中呈黄色,在碱性情形中呈蓝色.在分别造就基（pH6.8）中加处溴酚绿指导剂后呈蓝绿色,乳酸菌在该造就基中发展并分化乳糖,产生乳酸,使菌落呈黄色,菌落四周的造就基也变成黄色.乳酸可用纸上层析法辨别.3材料3.1 样品黑曲霉种曲.酸奶.3.2 器具及其他用品平皿.三角瓶.涂布器.试管.玻璃珠.纱布.3.3 造就基及试剂2%淀粉察氏造就基.BCG牛乳造就基.0.02mol/L碘液.10%牛乳造就基.无菌心理盐水.4 流程4.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选熔化造就基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→滴加碘液→挑菌落→接种→造就→糖化酶活气测定→菌种保管4.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别制造就基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→挑菌落→接牛乳管→造就不雅察→传代造就→遴选凝乳管→乳酸测定→菌种保管5 步调5.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选（1）熔化淀粉察氏造就基,稍冷后倒平板与斜面数个.（2）取种曲少许,参加10mL带玻璃球的无菌心理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成平均的孢子悬浮粒.然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中.（3）将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各0.2mL,于淀粉察氏造就基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30℃造就1~2d.（5）机能测定：测定各菌落的糖化酶活气.5.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别（1）制备BCG牛乳养分琼脂造就基.①称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,参加1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL,0.075MPa压力下灭菌20min.②另取琼脂2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,消融后调pH值至6.8,0.1MPa压力下灭菌20min.③趁热将上述两液以无菌操纵混淆平均,倒平板6个,待凝固后,置37℃造就24h,若无杂菌发展,即可应用.（2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取个中10-7.10-6 2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL,分别置于上述各养分平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基亦为黄色者初步定为乳酸菌.（3）将典范菌落转至脱脂乳发酵管,43℃造就8~24h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其持续传代若干次,43℃造就,遴选出在3~4h能凝固的乳管,保管备用.（4）乳酸菌的判定及生物量的测定.6 成果（1）描写黑曲霉分别株的形态特点及其分生孢子头的生态.（2）绘制所分别的乳酸菌形态图,并记载成果.7 思虑题（1）为什么消融样品的瓶内要参加玻璃珠？（2）解释用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何干系？（3）哪些情形可以或许引起凝乳？。
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（一）根据土壤特点
1．土壤有机质含量和通气状况
耕作土、菜园土、近郊土壤，森林土，贫瘠土壤
土样最好的土层是5-25cm、一般每克土中含菌数约 几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几 乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约510 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。厌氧菌 分布较深。
3、斜面保存培养基（20% PDA）：马铃薯20%，葡萄糖 2%，琼脂1.8%，自然pH，121℃灭菌30min；
4、液体种子培养基(YEPD)[9]：葡萄糖2%，酵母 膏1%，蛋白胨1%，自然pH，121℃灭菌20min； 5、液体发酵培养基(YEPD)[9]：葡萄糖4%，酵母 膏1%，蛋白胨1%，pH 6.0 ，121℃灭菌20min； 6、鉴定用培养基[10]：5%麦芽汁培养基，12.5% 豆芽汁培养基，尿素液体培养基，无碳培养基， 无氮培养基，尿素液体培养基，Gorodkowa培养基， 马铃薯块培养基。
第五节
野生型目的菌株的筛选 和菌株鉴检筛方法 2．摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广,通 过该法可淘汰85-90%不符合要求的微生物 二、复筛 一个菌株通常要重复3-5个瓶，培养后的发酵液 采用精确分析方法测定
三
菌株鉴定
菌落形态，个 体形态，革兰 氏染色，生理 生化，分子鉴 定
工业菌种
几乎所有的培养物 真菌类 动植物细胞系 微生物菌种
韩国典型培养物保藏中心(KCTC) 韩国 培养物 俄罗斯微生物保藏中心(VKM) 俄罗斯 工业微生物 俄罗斯科学院微生物理化所(IBFM VKM) 俄罗斯 所有培养物 俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM) 俄罗斯 工业菌种 斯洛伐克酵母保存所(CCY) 斯洛伐克 酵母菌 西班牙普通微生物保藏中心(CECT) 西班牙 普通微生物菌种 英国藻类和原生物动物保藏中心(CCAP) 英国 藻类、原生动物 欧洲动物细胞保藏中心(ECACC) 英国 动物细胞系等 国际真菌学研究所(IMI) 英国 真菌、细菌等 英国国家食品细胞保藏中心(NCFB) 英国 工业细菌 英国国家典型培养物保藏中心(NCTC) 英国 普通微生物 英国国家酵母菌保藏中心(NCYC) 英国 酵母菌 英国国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB) 英国 工业及海洋细菌 美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL) 美国 以微生物菌种为主 美国典型培养物保藏中心(ATCC) 美国 几乎所有的培养物
2、公共浴室红色附着物中红酵母的分离 3、空气中红酵母的分离 4、果园土壤、汽车修理厂土壤中红酵母的分离 5、醪糟、葡萄汁中红酵母的分离
分离筛选用培养基
1、平板筛选培养基（20% PDA）：马铃薯20%，葡萄糖 2%，琼脂1.8%，自然pH，121℃灭菌30min； 2、富集培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH， 121℃灭菌30min；
第四节
厌氧微生物的分离
一、厌氧培养中几种除氧的方法
（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D 型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速 度划线分离，然后立即置于事先已抽真空 密闭的容器内（充CO2或N2），适温培养。
（二）焦性没食子酸法 （1,2,3-三羟基苯） （三）平皿厌气培养法
2.根据微生物的生理特性
高温、低温、耐压、耐高渗等
三、特殊环境下采样 1．局部环境条件的影响
特定微生 物的分离
2．极端环境条件的影响
嗜极菌 嗜压、嗜酸 嗜减
第二节 含微生物样品的富集培养
富集培养（enrichment breeding)：是在目的 微生物含量较少时根据微生物的特点设计一种 一、控制培养基的营养成分 选择培养基，创造有利的生长条件，使目的微 生物在最适的环境下迅速生长繁殖，数量增加， 由原来的自然条件下的劣势菌株变成人工环境 1 根据环境条件选择合适的培养基 下的优势种，以利分离到所需菌株。 2、根据微生物的类型 富集培养主要是根据微生物的碳源、氮源、pH、 3、根据微生物对环境的耐受范围具有可塑性 温度、需氧等生理因素加以控制。 的特点(抗性菌株、污染物分解菌）
6、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样 在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可简 少细菌和链霉菌的数量。 7、分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别 将样品在高浓度酒精和高浓度甘蔗溶液中处理 一段时间。杀死非目的微生物后再进行分离。 从土壤中分离芽孢杆菌 对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生 物时，采用富集培养可以提高分离工作效率。
五 单细胞或单孢子分离法 1、小滴分离纯化方法 稀释样品为1500/ml，滴管4000d/ml 2、滤纸片法
六、通过控制营养和培养条件进行分离
1.培养基的营养成分 2.培养基的pH 3.排除不需要的菌类 4．控制培养温度
50-60℃ 20-40℃ 15℃或更低
（1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U／ml制霉菌素； 可以抑制霉菌和酵母菌的生长。 （2）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 ％十二烷基磺酸钠 （SDS）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的菌 丝。加人氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素 （0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的 生长。 （3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素 和四环素各30U／ml，可以抑制细菌和放线菌生长。 （4）分离根霉和毛霉在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨 醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体 等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。
菌株的分离和筛选一般可分以下几个步骤: 采样 富集 分离 产物鉴别 生化鉴定
第一节
含微生物样品的采集
一、从土壤中采样 1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律： 细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106） ＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动 物（103）
一 稀释涂布法 二 划线分离法 三 利用平皿的生化反 应进行分离 1．透明圈法 2．变色圈法 3．生长圈法 4．抑菌圈法
饱浸含某种指示 剂的固体培养基 的滤纸片变色圈
固体培养基中渗入溶解性 差、可被特定菌利用的营 养成分，造成不透明的培 养基背景。菌落利用此物 质形成透明圈。
指示剂直接掺入或喷洒固 体培养基，菌落周围形成 变色圈。如淀粉的平皿上 喷上稀碘液
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各 种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实 际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方 法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生 物的过程。 工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一 是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的 野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
第五章 工业微生物产生菌 的分离筛选
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
含微生物样品的采集 含微生物样品的富集培养 好养微生物的分离 厌氧微生物的分离 野生型菌株的筛选和菌株鉴定 极端环境微生物的分离筛选 生物可降解塑料菌株的分离筛选
菌种是发酵工业的关键
三个步骤：1、获得该微生物的纯种培养物；
2、测定一系列必要的鉴定指标；
3、根据权威性的鉴定手册进行菌种鉴定。 四个水平：细胞形态和习性水平；细胞组分水平； 蛋白质水平；基因或DNA水平。
例子：高产类胡萝卜素红酵母的分离 筛选
取样 富集培养（初筛和复筛） 菌株鉴定
取样及筛选
1、水池边红色附着物中红酵母的分离
待筛选的菌株能 分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕 该菌生长
四
组织分离法
1．对一般有病组织的分离方法 用10%漂白粉或0.1升汞浸泡 2．食用菌孢子分离法 （1）多孢子分离法 （2）单孢子分离法：单孢子稀释
（四）试管厌气培养法
（五）玻璃板隔绝空气培养法 （六）生物吸氧法 除以上的方法外，还有肝块肉汤培养， 高层琼脂法，共栖培养法等 实例： 1）保加利亚乳杆菌的分离筛选 2）反硝化细菌的分离
（ 1 ）单个平皿法
按常规在琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器 中加热融化。取方形玻板一块 , 中央置纱布或重叠滤纸一小 块 , 上面放焦性没食子酸 0.5g ，加 10 ％氢氧化钠溶液 0.5ml 后迅速将平皿底倒置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。 置 37 ℃温箱培养 2-3d ，取出观察。
第三节 好氧微生物的分离
较粗放的分离方法 “菌落纯” 如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等 。 组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离 菌株。
较细的分离方法 “菌株纯” 单细胞或单孢子分离方法” 这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显 微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作 分离小室进行分离、
菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：
（1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
国际承认的培养物保藏单位 保藏单位(简称) 所在国家 澳大利亚国家分析试验室(AGAL) 澳大利亚 比利时微生物保藏中心(BCCM) 比利时 保加利亚菌种保藏库(NBIMCC) 保加利亚 中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 中国 中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC) 中国 捷克微生物保藏所(CCM) 捷克 法国微生物保藏中心(CNCM) 法国 德国微生物保藏中心(DSM) 德国 匈牙利国家农业和 工业微生物保藏中心(NCAIM) 匈牙利 日本国家生命科学 和人类技术研究所(NIBH) 日本 荷兰真菌保藏所(CBS) 荷兰 韩国细胞系研究联盟(KCLRF) 韩国 韩国微生物保藏中心(KCCM) 韩国 保藏范围 微生物菌种 大部分微生物菌种 微生物菌种 几乎所有的培养物 普通菌种 普通微生物菌种 几乎所有的培养物 普通微生物菌种