枯草芽孢杆菌的分离及筛选

微生物设计性实验

枯草芽孢杆菌的分离及筛选

1 实验目的

掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。

2 实验原理

枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

3 实验材料

3.1 选择培养基

本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方：

牛肉膏5.0g

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

可溶性淀粉10.0g

琼脂20g

蒸馏水1000ml

调整pH 至7.2

配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2 溶液或试剂

牛肉膏1.25g

蛋白胨2.5g

氯化钠1.25g

可溶性淀粉2.5g

琼脂5g

碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。

3.4 仪器或其他用品

平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

4 实验流程

倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存

5 实验步骤

实验前准备

制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。

5.1 制备土壤稀释液

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，铲产去表层5cm，取5～15cm 处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。

用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。

5.2 涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。

5.3 培养

将淀粉培养基平板倒置于30°C培养箱中培养1～3d。

5.4 初筛

观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。）5.8 复筛

测定其淀粉酶活。

5.8.1 试剂和器材

1、试剂：

（1）碘原液：称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。

（2）稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。

（3）2%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH为6）

（4）柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23克，柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。

（5）标准比色液：称取氯化钴（CoCL2·6H2O）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01N HCL，其五倍稀释作标准。

（6）样品：细菌-α淀粉酶

2、器材

（1）电热恒温水浴（2）试管

（3）量筒（4）吸量管（1ml）

5.8.2 操作方法：

1、取试管1支，加20毫升2%淀粉，混匀，在30℃水浴中，使管内温度达到30℃。

2、将淀粉酶0.5ml加到30℃的淀粉液中，混匀，在30℃水浴中保温，自加入记时，经

5分钟后取反应液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的试管中。混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，记录反应进行的时间。

3、计算。在上述条件下，每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定为一个酶活力单位。

5.9 纯化并保存

菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时，做好以下工作：

（1）做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。

（2）防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3只试管中备用。

（3）原始菌种妥善保存。

6 结果与分析

6.1 分离到枯草芽孢杆菌菌的株数

6.2 枯草芽孢杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果

【注明参考文献，格式参考学术论文样式】

枯草芽孢杆菌的鉴定实验

1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）

（1）单个菌体的形态

（2）群体形态的观察

2、革兰氏染色

3、芽孢染色

4、菌体大小测量

5、枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定：

一、过氧化氢酶测定

1、原理：过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧

2、试剂：3～10%过氧化氢

培养基：肉汤琼脂培养基

3、操作步骤：将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30 培养1～2 天。取一干净载玻片，在上面加一滴3～10%的过氧化氢，挑取一环培养1～2 天的菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

二、需氧性试验

1、原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。

2、培养基：半固体培养基

3、操作步骤：用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于30 培养3— 7 天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌三、乙酰甲基甲醇实验1、原理：本实验是测定芽孢杆菌（或其他细菌）发酵葡萄糖的变化。有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或的胍基起作用，生成红色化合物，即表示2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含V.P. 试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。反应式如下： 2 丙酮酸—— >乙酰甲基甲醇+ 2 二