食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术

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微生物的分离和纯培养

在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。

由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。

因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。

培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。

有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。

为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。

而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

2、接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。

由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。

土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏

番红 G-
显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色阴性细菌 (常以G-表示)，呈深蓝紫色者为革兰氏染色阳性反应细菌(常以G+表示)。
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色实验步骤
制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗；媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,
相关理论知识（2）
土壤中的微生物
✓土壤是微生物生长繁殖的天然培养基，是人类最丰富的“菌种资源库”。
✓不同类型的土壤、同一类型土壤的不同深度或不同水平位置，微生物种类和数量变化很大。
✓由于表层土壤比较干燥，且接受大量紫外线照射，所以微生物主要分布在营养条件良好、氧气含量比较丰富的浅土层
每克耕作层土壤含菌量十倍递减细菌（~108）
细菌细胞的生理生化反应
目的要求
1、不同微生物对各种有机分子水解能力不同，说明不同微生物有不同的酶系统。
2、掌握微生物大分子水解实验的原理及方法。 3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。 4、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验
原理和方法。 5、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物
大
中
小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μm
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
细菌的革兰氏染色
注意事项
1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。火焰固定不
宜过热。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳
性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4．不能选用老龄菌。
在鉴别细菌中的意义。
细菌细胞的生理生化反应
实验原理（1）
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们有不同的酶系统。

微生物的保藏技术

法国标准生物保藏中心
法国国家历史自然博物馆——Algotheque du实验室菌种保藏中心 Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National d'Histoire Naturelle（ALCP）
ALCP隶属于法国国家历史自然博物馆，主要从事于工业微生物学，应用微生物学，微生物系统分类学，培养和保藏方法等方面的研究，以及藻类等微生物的分离，鉴定，保藏工作。保藏有藻类600种、细菌200种。该中心保藏的菌种可出售。
日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心 Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC)
传代培养保藏
一、传代培养保藏
1 原理 2 优缺点 3 注意事项
传代培养的原理
有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
德国与韩国标准生物保藏中心
德国微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有 9400种细菌、2400种真菌、500种酵母菌、300 种质粒、500种动物细胞、500种植物细胞、170 种动物杂肿瘤、600种植物病毒、90种细菌病毒等（德文，英文）。
韩国国家农业生物技术研究所——农业微生物菌种保藏（KACC），保藏有细菌890种、真菌 1581种、酵母菌62种、cDNA 600种（英文）。
二、保藏方法将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷
冻保存。
菌种保藏的共同注意点：

《食品微生物检验》习题库完整

习题库项目一食品中的微生物及其检验一、名词解释1、微生物：2、食品微生物检验：3、食品变质：4、腐败：5、酸败：6、菌落总数：7、大肠菌群：8、MPN：二、填空题1、食品中的微生物的主要来源是、和。

2、引起食品腐败变质的原因主要有、、和等方面，其中，最普遍、最主要的因素是。

3、分解蛋白质的微生物以为主，其次是和。

4、分解糖类的微生物以为主，其次是和。

5、分解脂肪的微生物以为主，其次是和。

6、国家食品卫生标准一般包括三个方面的内容：、和。

7、微生物指标一般分为、和三项。

8、食品微生物检验包括和两个方面。

三、选择题1、下列描述的微生物特征中，不是所有微生物共同特征的是（）A.个体微小B.分布广泛C.种类繁多D.可无致病性E.只能在活细胞内生长繁殖2、土壤中，数量和种类最多的微生物是（）A、细菌B、霉菌C、酵母菌D、放线菌3、我国城市饮用水卫生标准规定（）A、每1000ml水中大肠杆菌＜3个B、每1000ml水中大肠杆菌＜30个C、每100ml水中大肠杆菌＜3个D、每100ml水中大肠杆菌＜30个E、每500ml水中大肠杆菌＜3个4、我国城市饮用水卫生标准规定（ E ）A、每ml水中细菌总数＜1000个B、每ml水中细菌总数＜10个C、每100ml水中细菌总数＜10个D、每500ml水中细菌总数＜10个E、每ml水中细菌总数＜100个四、判断题1、菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。

（）2、MPN是指可能产气的数量。

（）3、食品中病原微生物的检验，可以检验出少量的病原微生物（）五、问答题1、食品微生物检验的特点有哪些？2、食品微生物检验的任务是什么？3、食品微生物检验的内容主要包括哪些方面？每一个方面的检验项目是什么？4、食品质量的评价指标有哪些？并具体解释之。

5、食品微生物检验的意义是什么？6、食品中细菌总数检验的意义是什么？7、食品中大肠菌群检验的意义是什么？项目二食品微生物检验的基本条件与设备一、名词解释1、分辨力：2、相位：3、振幅：二、填空题1、无菌室通常包括和两部分，这两部分的比例一般为，高度一般 m左右。

微生物分离纯化与接种技术

微生物分离纯化与接种技术微生物分离纯化与接种技术微生物学是一门研究微生物的学科，在医学、食品工业、环境保护等行业有着广泛的应用。

而微生物的研究需要用到微生物分离纯化与接种技术，这些技术可以让我们有效地获取纯净的微生物，并在实验室中控制其生长条件，从而更好地研究微生物的特性和应用价值。

按照微生物的性质，可以将微生物分为细菌、真菌和病毒三大类。

不同的微生物类型需要不同的分离纯化与接种技术。

细菌分离纯化技术是微生物学中最基础的技术，其中最常用的方法就是传统的培养基分离法。

这种方法直接将微生物置于固体培养基中，允许其在特定的温度和pH条件下生长，然后通过形态特征和生长习性的观察，将细菌区分出来。

而对于那些难以直接用固体培养基分离纯化出来的细菌，我们还可以采用流式细胞术分离法、限制性酶切片段长度多态性分析法等先进的分离技术。

真菌分离纯化技术一般采用无菌活体动物或者人工培养基的方法。

在真菌分离和鉴定时，需要根据真菌的外部形态、菌丝的生长特性和菌落的颜色等特征来进行区分和鉴定。

为了保证真菌的纯度，我们也需要通过重复传代、提取DNA序列、限制性酶切片段长度多态性分析等方法进行多角度的鉴定，以确保纯化出来的真菌种类正确。

病毒是一种极小的微生物，一般无法在常规的细胞培养中生长。

因此，分离纯化技术对于病毒的研究尤其重要。

常见的病毒分离技术有鸡胚培养、细胞培养等。

鸡胚培养可以在和病毒感染相同的生理和代谢环境下使病毒生长，而细胞培养则是让病毒通过培养基中细胞对它的反应来分离纯化。

此外，病毒也可以通过电镜、PCR等现代分析技术来进行分离纯化和鉴定。

接种技术是指将纯化出来的微生物直接加入到培养基或其他基质中，让它们在有利的环境中进行生长和加工。

接种技术对于微生物学的研究至关重要，它可以帮助我们更好地了解微生物的特性，有效地应用于医学、环境保护、食品工业以及其他相关行业。

总之，微生物分离纯化与接种技术是微生物学中的重要技术，在微生物学和相关行业中有着广泛的应用。

微生物的纯种分离与培养技术

纯种分离困难
微生物间的竞争和共生关系使得纯种分离变得困难。
培养条件限制
不同微生物对生长环境的要求各异，培养条件的限制使得某些微生物难以培养。
培养基要求高
某些特殊微生物对培养基的要求极高，且培养基的制备过程复杂。
未来发展方向
高通量技术应用
利用高通量技术进行大规模筛选，提高微生物
分离效率。
基因编辑技术
纯培养
将目标微生物分离出来，在单一培养基中培养至纯种。
连续培养
在一定条件下持续培养微生物，用于研究生长动力学和控制培养过程。
微生物培养的条件控制
01
02
03
04
温度
根据微生物的种类和生长阶段，控制适宜的温度以促进微生物的生长。
pH值
调节培养基的酸碱度，以满足不同微生物对酸碱度的需求。
微生物生态分布广泛
微生物在各种环境条件下都有分布，如土壤、水域、空气、动植物体等，它们在自然界中发挥着重要的生态功能。
微生物遗传多样性丰富
微生物具有丰富的基因多样性，通过基因重组和突变等方式，可以产生多种多样的遗传变异，为生物进化提供了丰富的资源。
微生物纯种分离的必要性
80%
保证实验结果的可靠性
在微生物学研究中，为了获得准确的实验结果，需要使用纯种的微生物作为实验材料，避免不同菌种之间的干扰。
100%
满足生产需求
在工业生产中，如食品、药品、化学品等领域，需要使用纯种的微生物进行发酵、生产等过程，以保证产品的质量和产量。
80%
保障人类健康
在医学和公共卫生领域，对病原微生物进行纯种分离和鉴定，有助于疾病的诊断、预防和治疗，保障人类健康。

微生物接种、分离纯化与培养

（2）分离现象通过遗传育种获得的多核（或是单核）菌种，由于其DNA双链中仅一条单链发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身不纯，高产突变只发生在一个核和一条DNA 单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因而突变基因与未突变基因发生分离，于是就出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。
（3）冻结液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国 ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟降低 1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。（4）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速解冻，当升温至 0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。
项目六接种、分离纯化与培养
学习目标 • 了解微生物的遗传和变异 • 熟悉微生物保藏的原理和方法 • 掌握微生物接种、分离与培养的方法
微生物的遗传和变异
遗传：亲代与子代相似
亲代与子代、子代间不同变异：个体不完全相同
微生物遗传和变异的物质基础：
染色体
质粒
微生物变异的类型：
表型变异
环境发生变化暂时可逆不可遗传
物品清点与摆放超净工作台的消毒手消毒接种微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体通过在平板上划线可得到单个菌落因此可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物融化培养基倒平板做分区标记分区划线操作恒温培养菌落清理涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液置于已凝固的无菌平板培养基表面然后用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平板表面禁培养或在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落然后挑取典型的代表移至斜面经培养后保存适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离与计数倒平板菌液稀释涂布平板平板培养菌落滴加菌液

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（一）菌种保藏的目的

保持其原有性状和活力的稳定；确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处于受抑制的休眠状态。保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
•斜面低温保藏法 • 砂土管保藏法 •石蜡油封藏法 •冷冻真空干燥保藏法 •滤纸保藏法 •甘油悬液保藏法 •液氮超低温保存
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
微生物菌种的分离纯化
分离：
1、倾注平板法
先加菌
注意培养基温度，混合均匀
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微生物菌种的分离纯化
分离：
2、涂布分离法
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微生物菌种的分离纯化
3、平板划线法
1) 倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。 2）划线方法
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微生物菌种的分离纯化
二、实训原理
分离纯化技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离纯化：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。
纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
思考与讨论 1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？ 2. 接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？
模块二：微生物检验基础技能训练
8 微生物分离、纯化与保藏技术
8.2 微生物菌种的保藏
广东食品药品职业学院食品科学系
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法： 4、真空冷冻干燥法
低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥、封装，隔绝空气，微生物的生长和酶活动停止。达到长期保藏的目
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
二、菌种的复壮 (一)菌种的提纯 (二)通过寄主体进行复壮
(三)淘汰已衰退的个体
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(一)菌种的提纯
从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。菌种提纯：
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菌种的保藏与菌种管理
一、菌种退化
菌种退化：菌种在自发突变的影响下，引起某些优良特性降低或丧失的现象。
生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；
菌种衰退原因：基因突变
菌种保藏与复壮工作:为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退
真空冷冻干燥法优点：具低温、干燥、除氧主要因素，适用于除丝状真菌的菌丝体外的其它各类微生物。菌种存活时间长、效果好，一般可保存 5 年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。
冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌＞放线菌＞真菌
体积小、不易污染、便于运输，为最广泛的菌种保藏法。
只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，适用于退化不太严重的情况。
要求达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。
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菌种的保藏与菌种管理
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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8 微生物分离、纯化和保藏技术微生物菌种的分离纯化4、富集分离法利用选择培养基
创造只让所需微生物生长的条件，所需微生物有效地与其他微生物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。
菌落4
菌落5
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微生物常规鉴定、筛选
1、微生物菌落特征 1）肉眼观察湿润，正反面颜色一致
小、扁平或隆起
细菌酵母菌放线菌霉菌
菌落
干燥，正反、中央与边缘
大、扁平或隆起
小、而致密
大、疏松、颜色不一致
2）细致区分还要用显微镜，观察细菌形态。
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
矿油保藏法特点：
适用于各大类不产孢子的微生物菌种的中期保藏不适用于能分解烃类的菌种的保藏。主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。
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＞藻类，而菌丝体不宜用此法保存。
冷冻真空干燥操作流程
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微生物菌种的分离纯化
四、实训方法与步骤
取样制备稀释液分离
0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1m l
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8 微生物分离、纯化和保藏技术
沙土按 3 ： 2 或 1 ： 1 混合装入指形管或高 100mm ，直径为 10mm的小试管，高约1cm(约2g)，塞棉塞121℃湿热灭菌1h，也可170℃2h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。
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(三)菌种保藏方法： 1.斜面低温保藏法－－常用保藏法菌种接种斜面培养基生长健壮的菌种定期移植至新培养基
4℃左右的冰箱中保藏
继续保藏
适用菌种的短期保藏
特点
一般可保存1～6个月左右。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
保藏期短传代次数多易发生变异易被污染
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及衰退现象。可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)淘汰已衰退的个体
通过物理、化学的方法处理菌体 ( 或孢子 ) ，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。
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菌种的保藏与菌种管理
三、菌种保藏
菌种保藏：是使微生物种子经过长时间保存后，尽可能保持其原来性状和活力不变，不死亡、不污染
如分离专性寄生菌，须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中，使其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。
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微生物菌种的分离纯化
５、厌氧法
利用装原培养基的试管作培养容器，在沸水浴中加热数分钟，逐出培养基中的溶解氧。快速冷却，并进行接种。加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。或在接种后，用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上试管口密封。
为了更有效地分离某些厌氧菌，可把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
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第一节微生物菌种的分离纯化
五、实训结果
（一）菌落观察
菌落菌落1 菌落2 菌落3 大小形状表面边缘湿润度透明度色素菌名

微生物移接方便，经济简便。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
3、矿油保藏法（石蜡油低温保藏法）
长好的斜面菌→覆盖灭菌液体石蜡 →菌体与空气隔绝→ 直立保藏于-4～4℃低温或室温注意事项：
斜面培养菌种，斜面不宜过长；纯净优质石蜡油，置三角烧瓶经 121℃高压蒸汽灭菌 1 ～ 2h ，放烘箱中(160℃左右)干热处理，除灭菌时渗入水分，待石蜡油变清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种斜面产孢孢子悬浮液（≥106/ml ）减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管）密封 4℃低温保藏