微生物的分离与纯化
微生物的分离纯化方法
微生物的分离纯化方法微生物的分离纯化方法是微生物学研究的重要内容之一，旨在从混合的微生物群落中分离出单一种类的纯培养菌株。
微生物的纯化有助于研究其生物学特性、代谢途径以及应用领域等方面的深入研究。
下面将介绍常用的微生物分离纯化方法。
1. 单菌分离：是最常见的微生物分离方法之一。
通常使用传统方法（如分离培养基、落菌法、抗生素筛选等）以及现代分子生物学的技术手段（如16S rRNA 测序、荧光原位杂交等）对微生物进行筛选和分离，获得纯培养菌株。
2. 稀释平板法：是一种简单易行的微生物分离方法。
将待分离样品适当稀释后均匀涂布于富含适宜生长因子的平板培养基上，使微生物在固体培养基上形成单个菌落，然后用针头或者扩展环等工具将单个菌落接种于新的培养基上，形成纯培养单菌。
3. 滤膜方法：利用0.2μm以上的滤膜可以有效地将微生物和大颗粒物质分离开。
将待分离样品过滤，将滤膜放置于富含适宜生长因子的培养基上进行培养，从而获得纯菌落。
4. 凝胶去除法：主要针对混合微生物群落中细菌和其他微生物细胞凝胶的去除。
通过化学或物理方法（如酶解、超声波、渗透压等）将细胞凝胶分离离去，然后进行接种和培养，实现单菌分离纯化。
5. 选择性培养基法：利用特定的培养基，添加一定浓度的抗生素、染色剂或其他抑制物质限制其他微生物的生长，从而提高目标菌株的生长优势，实现单一种类的微生物分离纯化。
6. 微量稀释法：根据微生物的生长特性，将待分离样品进行多次连续稀释，然后分别在富含适宜生长因子的培养基上进行培养。
微生物的最高稀释度对应最大的菌落数目，可以通过对菌落的观察和计数，筛选到目标微生物。
7. 生物免疫法：利用微生物本身的免疫特性，通过制备抗体或其他免疫试剂对微生物进行分离纯化。
通过配对抗体和堆积生物试剂，将目标微生物从混合菌种中选择性地分离出来。
8. 流式细胞技术：是一种现代化的微生物分离纯化方法。
将待分离样品进行特定染色或标记，然后通过流式细胞仪对样品进行分析和排序，从而分离出目标微生物，实现单一种类微生物的分离纯化。
微生物的分离和纯化
微生物的分离和纯化一、基本原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
二、器材高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。
三、操作步骤1．稀释涂布平板法（1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。
试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，如图Ⅶ-1所示。
微生物的分离和纯化
1、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
2、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
3、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
4、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。
在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
微生物的分离与纯化-环境工程
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
1ml
∪
0.5ml
〇 〇 37℃培养 〇 〇 28℃培养
四、教师演示：
1、涂布 2、混合 3、划线 ..\微生物 \MPEGAV\AVSEQ01.DAT(19min) .\微生物\MPEGAV\AVSEQ02.DAT
实验结果示例1：
☆涂布
实验结果示例2：
☆划线
五、实验内容：
一、实验目的：掌握倒平板的方法和几种
常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 二、基本原理：从混合的微生物群体中获 得只含有某一种或某一株微生物的过程 ——即为微生物的分离与纯化。
常用方法：
1、单细胞挑取法：适用专业性研究； 涂布：先倒平板，后加 样 再涂布； 2、平板分离法 混合：先加样，后倒平板 混合均匀； 划线：挑取菌种，也可挑 取土壤悬液。
两皿涂布。
1、细菌培养基
一皿划线。 两皿混合。 ★ 把上述平板放入37℃培养培养箱培养。
※ 同学每人做两皿涂布、两皿混合（不同稀释度） 一皿划线共五套平板倒置培养
பைடு நூலகம்
六、实验材料：
涂棒 、接种环 、培养皿 、酒精灯 火机 、 酒精棉球
下次实验：显微镜使用与微生物形态观察
七、实验报告：
1、统计结果，计算出1g土壤的微生物含量； 2、思考题：
三、采集样品：
1、土壤中微生物及其丰富，是微生物多样化 的重要场所。作为科研或毕业课题要有目 的到尽可能分离到的地方去采集土样。 ☆ 举例： 2、制备土壤稀释液： 称取1g土样，放入90 ml的水，在三 角瓶中充分摇匀——细胞分散
▲梯度释稀：
9ml水 9ml水 9ml水 9ml水 9ml水
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
微生物的分离与纯化实验报告
微生物的分离与纯化实验报告微生物的分离与纯化实验报告引言：微生物是一类非常微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，同时也存在于人体内。
微生物对人类的生活和健康具有重要影响，有些微生物可以引起疾病，而另一些微生物则可以用于食品发酵、环境修复等方面。
为了更好地研究微生物的特性和功能，需要对其进行分离与纯化实验。
材料与方法：1. 样品采集：我们选择了土壤样品作为研究对象，从自然环境中采集了多个不同地点的土壤样品。
2. 稀释与接种：将采集到的土壤样品进行适当稀释，然后在琼脂平板上接种。
3. 培养与分离：将接种好的琼脂平板置于恒温箱中，以适当的温度和湿度进行培养。
经过一段时间后，我们观察到在琼脂平板上形成了不同形状和颜色的菌落。
4. 单菌分离：选择单个菌落，用无菌的铂丝将其转移到新的琼脂平板上，进行二次培养。
重复此过程，直到获得纯净的单菌培养物。
5. 形态观察：观察纯菌培养物的形态特征，包括菌落形状、颜色、透明度等，以及菌体形态特征，如细胞形状、大小等。
6. 生理生化特性检测：对纯菌培养物进行一系列生理生化特性检测，包括氧需求性、温度适应性、酸碱耐受性、产酶能力等。
7. 16S rRNA测序：对纯菌培养物进行16S rRNA基因测序，以确定其系统发育地位和亲缘关系。
结果与讨论：经过分离与纯化实验，我们成功地获得了多个不同的微生物菌株。
通过形态观察，我们发现这些菌株在菌落形状、颜色和透明度等方面存在显著差异。
进一步的菌体形态观察发现，它们的细胞形状和大小也各不相同。
在生理生化特性检测中，我们发现不同菌株对氧的需求性、温度适应性和酸碱耐受性存在差异。
有些菌株需要氧气才能生长，而另一些则可以在无氧条件下生长。
对于温度适应性，有些菌株在低温下能够生长，而另一些则喜欢高温环境。
此外，我们还发现一些菌株对酸性环境更耐受，而另一些则对碱性环境更适应。
通过产酶能力的检测，我们发现一些菌株具有蛋白酶、淀粉酶等多种酶的产生能力，这对于它们在环境修复和食品工业中的应用具有重要意义。
微生物的分离与纯化
常用的微生物分离纯化方法1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。
该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。
待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。
于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。
每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。
挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。
若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。
在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。
待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。
另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。
该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。
3. 平板划线分离法先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。
微生物的分离纯化技术
微生物的分离纯化技术
微生物的分离纯化技术是指将混合微生物分离出单一种类，然后纯化该种类的技术。
以下是一些微生物的分离纯化技术：
1. 筛选法：通过选用某种特定培养基或特定条件（如pH、温度等），筛选出具有特定特性的微生物。
2. 稀释法：通过依次将样品进行稀释操作，使微生物的种类逐步减少，最终得到单种微生物。
3. 分离培养法：将混合样品分别涂布于不同的培养基表面，使微生物在不同培养基上生长和形态表现不同，最终分离出单一微生物。
4. 过滤法：通过将混合液体经过细孔过滤器，将细菌和病毒分离出来。
5. 凝胶电泳法：将提取出来的DNA通过凝胶电泳分析，识别出目标微生物并进行纯化。
6. 酶标记技术：利用特定抗体或酶标记系统与目标微生物进行特异性结合，分离出单一微生物。
总的来说，微生物的分离纯化技术需要根据不同的样品和目的选择不同的方法，
并结合多种技术手段才能最终得到纯种微生物。
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基本原理：是通过稀释使菌体细胞充分 分散，单细胞得以生长发育形成菌落， 可使用稀释法或平板划线法进一步纯化， 还可通过平板菌落计数，推算单位重量 土壤样品含有微生物的数量。
实验步骤：
1、采样一般定点于耕作层0--20cm，先除 去表土1--2cm，以无菌铲采土足量充分混 匀后用无菌塑料袋分装。
2. 培养基的制备与分装
（1）三角瓶固体培养基的制备 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） 2. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 3.完全溶解后，补充水分，调pH值（不要调 过头） 4.分装置三角瓶中，注意装液量 5. 加棉塞，包扎，高压蒸汽灭 菌,121℃,0.10Mpa,20min
1、牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏 3.0g、蛋白胨 10g、 NaCl 5.0g、水1000ml、 PH7.4-7.6 2、高氏1号培养基（放线菌） 可溶性淀粉 20g 、 NaCl 0.5g、琼脂 15-20g、 FeSO4·7H20 0.01g、MgSO4·7H20 0.5g 、 KNO3 1g 、 K2PO4·3H20 0.5g、水 1000ml、 PH7.47.6 3、马丁氏培养基（真菌） KH2PO4 1g、 MgSO4·7H20 0.5g 、蛋白胨 5g、葡 萄糖 10g、琼脂 15-20g、水 1000ml、 PH
（2）试管斜面固体培养基的制备
a.称量按培养基配方比例依次准确地称取药 品，放入在瓷缸内。 （注意药品称量顺序） b. 加入定量的琼脂、水，煮沸，溶解 c.完全溶解后，补充水分，调pH值 d.在培养基未融化之前，用10mL移液管快 速加入试管内，每根7-8mL，塞上棉塞，包 扎，灭菌，灭菌完后摆斜面。
干燥箱
细菌过滤器
用于滤过除菌的各式滤器
手提式灭菌锅
坐 式 灭 菌 锅
卧式灭菌锅
高压蒸汽灭菌器
三、实验器材
1、试剂：牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、 NaCl、PH试纸、琼脂、葡萄糖、孟加拉红、 FeSO4· 7H20、MgSO4· 7H20、 KNO3、 K2PO3· 3H20 2.仪器及其它
吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉 花，用长纸条包扎、打结。 玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 三角瓶的包扎
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
（1）计算 （2）称量 准确称取各种成分。 （3）溶解 向烧杯内加入所需的水量，将牛肉膏用 水洗下后，取出硫酸纸弃去。加热搅拌全溶后稍 放冷。 （4）调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值， 并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱 脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压 蒸汽灭菌后，pH常降低。 （5）分装 根据不同需要，可将配好的培养基分装 入配有棉塞的试管或三角瓶内（附图1-1） （6）包扎 试管扎成捆。 （7）灭菌 高压蒸汽灭菌15~20min。
2、制备土样稀释液 吹吸几次混匀 另留一管不稀释留作对照（CK）
无菌操作
倾注法接种
先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接 入对应平皿中（每个平皿接入1ml），再向每 个平皿倾注约15 ml的牛肉膏蛋白胨培养基 （48℃）待冷凝，混合均匀。
分区划线法纯化
计数
要求30~300之间计数。CK除外 每克湿土样细菌数量 ＝平均菌落数×稀释倍数 土壤样品水分系数 ＝1∕（1–样品水分百分数） 土壤样品细菌数量（个∕克干土） ＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数
1、满足微生物生长培养所需的营养要素： 碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等 2、合适PH值 3、抑制其它微生物生长的物质。
分类
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌
分类
普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 三糖铁培养基 SS培养基 庖肉培养基
培养基的制备程序
1、调配 过滤 矫正pH（7.0-7.6） 分装过滤 灭菌（121.3℃，2030分钟） 鉴定是否有菌 放入冰 箱冷藏备用 2、因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫 正pH时应比所需的pH高 3、鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24 小时，然后观察
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天ห้องสมุดไป่ตู้、药匙、高压蒸 汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻 绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻 璃珠
四、实验方法和步骤
1、微生物常用玻璃仪器的包扎和棉塞的制作 培养皿的包装每10套一包，用旧报纸包扎 （或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。
思考题
1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检 查灭菌后的培养菌是无菌的？ 2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表 上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温 度？为什么？ 3. 土壤微生物分离要注意什么问题？ 4.管口、瓶口为什么要用棉塞？能否用木塞或棉 皮塞代替？为什么？
3.培养基、无菌水、器皿的灭菌
1.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内， 湿热灭菌。 2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面。 3.器皿放入干热灭菌箱内，加热灭菌。
二、土壤微生物的分离、纯化
土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同 类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物 通过分离进行纯培养，并能对特定类群进行数量 测定。
实验一、微生物的分离与纯化
一、培养基的制备与灭菌
1.牛肉膏蛋白胨培养基（细菌） 2.高氏1号培养基（放线菌） 3.马丁氏培养基（真菌）
二、土壤微生物的分离、纯化
实验目的
1、熟悉培养基制作原理； 2、通过对几种培养基的配制，掌握配制培 养基的一般方法和步骤； 3、了解加压蒸汽灭菌的原理，并掌握其具 体操作方法； 4、了解土壤微生物的分离纯化的基本原理； 5、学习并掌握微生物分离纯化技术方法。
一、培养基的制备与灭菌
培养基是人工配制的微生物生活环境， 其主要用途是繁殖及分离接种微生物， 传代或保存微生物，鉴别微生物的类属， 研究微生物的生理及生化特性，制造菌 苗、疫苗或其他微生物制剂等。其营养 成分包括微生物生长所需要的水分、碳 源、氮源、无机盐及某些生长因子（维 生素、辅酶）等。
二、实验原理