菌种鉴定
菌种鉴定
细菌基因组的提取：1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
B.加入400ul裂解液（40mM Tris-醋酸，20mM醋酸钠,1mM EDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37℃水浴1hr。
C.然后加入200ul 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep 管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3(1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
(2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
(3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
菌种鉴定
1.菌落来源：菌落来自2013年8月6号气雾剂二车间水点206
2.菌落形态描述：菌落呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐有光泽，菌落直径约3毫米
3.革兰染色、镜检描述：菌落染成红色即革兰氏阴性菌，短杆状
4.氧化酶实验：呈红色（阳性）则为假单胞菌；无色则为肠杆菌
5.API试剂盒的选择：假单胞菌选择API 20NE;肠杆菌选择API 20E
1.菌落来源：菌落来自2013年8月6号气雾剂二车间水点206
2.菌落形态描述：菌落呈橙红色，圆形凸起，边缘整齐有光泽，菌落直径约1毫米
（注：圈住的金黄色菌落是为了对比直径）
3.革兰染色、镜检描述：菌落染成红色即革兰氏阴性菌，长杆状
4.氧化酶实验：呈红色则为假单胞菌；无色则为肠杆菌
5.API试剂盒的选择：假单胞菌选择API 20NE;肠杆菌选择API 20E
若镜检为紫色，球形，则做触媒实验，触媒实验为阴性(不产生气泡)，API试剂盒选用API Staph；触媒实验为阴性则判断非葡萄球菌。
若镜检为紫色，芽孢状
，API 试剂盒则选用API CHB/E
若镜检为较大形态的球状
，API 试剂盒则选择API C AUX。
菌种质量鉴定
菌种质量鉴定
菌种质量鉴定是指对于已分离出来的菌株进行鉴定，以确认它们是否符合特定的分类标准。
这个过程涉及到对于菌株的生物学特征、形态特征、生理生化特征等方面的研究、分析和比较，以确定其分类位置和身份信息。
菌种质量鉴定是微生物学研究中的一个重要环节，它不仅有助于研究人员准确地了解某种菌株的特性和功能，还能够为相关行业提供有价值的参考和支持。
同时，菌种质量鉴定也是保证菌株资源共享和利用的基础，能够确保菌株的准确标识和分类，防止错误使用和混淆。
因此，菌种质量鉴定对于微生物学研究和应用具有十分重要的意义。
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菌种鉴定流程课件
菌种鉴定是微生物学研究的重要基础工作 ，对于揭示微生物的生态和进化关系、探 索生命科学的基本问题具有重要意义。
02
菌种采集
采集方法
01
02
03
采集方式
根据菌种类型和特性，选 择合适的采集方式，如表 面涂抹、深层挖掘等。
采集工具
根据采集需求，准备适当 的采集工具，如铲子、刀 具、试管等。
采集环境
选择适当的采集环境，如 土壤、水源、动物粪便等 ，并确保环境无污染。
ABCD
稀释分离法
将菌液进行稀释，然后涂布在培养基上，使菌落 分散生长，达到分离纯化的目的。
温度、pH等物理因素分离法
通过调节培养温度、培养基pH等物理因素，使 特定微生物生长繁殖，达到分离纯化的目的。
分离纯化的步骤
采集样品
选择适当的样品，并确保样品无 菌操作。
选择培养基
根据分离的微生物种类选择适宜 的培养基。
采集注意事项
采集安全
在采集过程中，注意个人 安全和卫生，避免交叉感 染。
采集代表性
确保采集的菌种具有代表 性，能够反映该地区的菌 种分布和特点。
采集量控制
根据需求适量采集，避免 过度采集和破坏生态环境 。
采集后的保存
保存容器
选择适当的保存容器，如密封袋 、试管等，并确保容器无菌。
保存环境
选择适当的保存环境，如干燥、阴 凉、避光等，以保持菌种的活性。
和鉴别。
结果分析的注意事项
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准确性
确保鉴定结果的准确性，避免误差和偏差。
完整性
确保鉴定结果的完整性，涵盖菌种的所有相关信 息。
3
可重复性
确保鉴定结果的可重复性，以便于验证和复现。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种测定方法范文
菌种测定方法范文菌种测定是对菌种进行鉴定和分类的方法，该方法对于研究微生物的生态学、系统发育学、感染病学以及农业、食品等领域都有重要的意义。
下面将介绍几种常见的菌种测定方法。
1.形态学方法：形态学方法是通过观察菌落形态、细胞形态、胞体结构等特征来对菌种进行鉴定。
该方法需要将菌涂于培养基上进行培养，然后观察菌落的形状、颜色、边缘、质地等特征，并通过显微镜观察细胞的形态、结构等特征。
形态学方法对于一些细菌和真菌有较高的鉴定准确性，但对于一些形态相似的菌种可能存在误判。
2.生理生化方法：生理生化方法是通过观察菌在不同生理条件下的代谢反应、酶活性、碳源利用等特征来对菌种进行鉴定。
该方法通常使用酸碱指示剂、酶、碳源等试剂来观察菌液的变化。
常见的生理生化测试包括氧需求情况、气体产物、酶的产生能力等。
这种方法对菌种的鉴定速度较快，但需要一定的实验技巧和设备。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是通过使用DNA序列作为鉴定手段，通过对细菌或真菌的核酸进行特定引物的PCR扩增，然后对PCR产物进行凝胶电泳和序列分析，最后对序列进行比对与分析来对菌种进行鉴定。
这种方法的优势在于高度准确性和灵敏性，并且能够鉴定难培养的菌种。
目前广泛使用的分子生物学方法包括16SrRNA序列分析、ITS序列分析等。
4.免疫学方法：免疫学方法是利用菌种特异性抗原与抗体之间的特异性结合来对菌种进行鉴定。
这种方法的优势在于快速、简单且灵敏度高。
典型的免疫学方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验、凝集试验等。
5.生态学方法：生态学方法是通过对菌在自然环境中的分布、多样性、数量等特征进行研究来对菌种进行测定。
该方法通过采集土壤、水体、空气等样品进行分离培养，然后对分离得到的菌属进行鉴定和分类。
生态学方法适用于对环境中的微生物进行研究和监测。
综上所述，菌种测定方法有许多种，包括形态学、生理生化、分子生物学、免疫学和生态学等方法。
不同的方法具有不同的优势和局限性，可以根据研究目的和需求选择合适的方法进行测定。
环境微生物菌种鉴定
环境微生物菌种鉴定微生物是地球上数量最多的生物，它们在我们的生活和环境中无处不在。
为了更好地利用和保护这些微生物资源，我们需要对它们进行鉴定和分类。
本文将介绍环境微生物菌种鉴定的基本方法和应用领域。
一、微生物菌种鉴定的基本方法1、形态学鉴定形态学鉴定是根据微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征对其进行分类和鉴定的一种方法。
通过观察菌落的形状、大小、质地、颜色、边缘特征等，可以初步判断微生物的种类。
2、生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测试微生物对各种底物的发酵反应和代谢产物的性质，判断其生理生化特性，从而对其进行分类和鉴定的一种方法。
常见的生理生化试验包括糖发酵试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验等。
3、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是基于微生物基因组序列差异对其进行分类和鉴定的方法。
该方法通过提取微生物基因组DNA，进行PCR扩增，然后进行序列比对，判断微生物的种类和亲缘关系。
二、环境微生物菌种鉴定的应用领域1、环境保护环境微生物菌种鉴定在环境保护方面具有广泛的应用。
例如，在污水处理中，通过鉴定微生物的种类和数量，可以优化污水处理工艺，提高处理效率。
在土壤污染治理中，通过鉴定能够降解特定污染物的微生物种类，可以针对性地设计生物治理方案。
2、生物多样性研究环境微生物菌种鉴定在生物多样性研究中具有重要意义。
通过对不同生态环境中的微生物进行鉴定，可以揭示不同地区和不同气候条件下的生物多样性特征，为保护生物多样性和生态平衡提供科学依据。
3、生物技术应用环境微生物菌种鉴定在生物技术领域具有广泛的应用。
例如，在生物制药中，通过鉴定微生物的种类和代谢产物，可以发现新的药物资源和开发新的药物。
在农业微生物肥料开发中，通过鉴定微生物的种类和生理生化特性，可以研制出具有特定功能的微生物肥料。
三、总结环境微生物菌种鉴定是微生物资源保护和利用的重要手段。
通过形态学、生理生化和分子生物学等方法对微生物进行分类和鉴定，可以更好地了解和利用这些资源。
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目前在细菌分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常 用的分子是rRNA。rRNA 结构既具保守性又具高变性。 保守性反映生物物种的亲缘关系,高变性则揭示生物 物种的特征核酸序列,是属种鉴定的分子基础。rRNA 的这种特性使得这一段核酸序列成为目前人们利用 PCR 技术检测不同细菌种间或种内差异的最为理想 的模板。
一般的菌种鉴定还是最常用16S rDNA分析.由于它能 快速准确地对微生物进行分类鉴定,所以它在分类学 中的核心地位不可替代,还是受人们的青睐.但当16S rDNA序列同源性大于99.5％时难以获得准确的鉴定 结果.
现状
卡拉胶：一种红藻多糖，由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃 半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的线性多糖。
REP-PCR指纹法
RAPD-PCR
RAPD-PCR是使用较短的寡核苷酸引物扩增一群长度不等 的DNA片段混合物，这些产物经琼脂糖凝胶电泳呈现出的 带型，反映了用于扩增模板的DNA分子的总体结构特征， 所以能够测出2个生物体（包括同一物种的不同个体）基 因之间的差异。亲缘关系越近的种，PCR扩增带型就越相 似，反之差异悬殊。
99 72 100 100 61
Zobellia galactanovora.AF208293 A*.AF468422 Psychroserpens mesophilus.DQ001321 Mucus bacterium.AY654753 Cytophaga baltica.AJ005972 Cytophaga fucicola.AJ005973
总结
筛选得到一株高产酶菌株QY201，该菌株具有酶活高、降解
速率快、并且能同时分泌出κ-、ι-、λ-卡拉胶酶等特点。
通过采用形态观察和16S rDNA技术，菌株QY201可以鉴定为 Cellulophaga属，命名为Cellulophaga sp.QY201。
加拿大Labatt公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中使 用5S和16SRNA基因进行PCR扩增，用于菌种的特性鉴定。已成功地 对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。
分子生物学鉴定
随着分子生物学技术的发展,PCR 技术以快速、敏感和特 异等优点迅速地应用到微生物检测领域 。 DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生 物的不同亚种/株系之间的差异。因此分子诊断对细菌的 分型比传统方法更为准确。
类别
PCR-RFLP分析法
分子生物学 菌种鉴定
16S rDNA序列分析法
Thanks!
加拿大Labatt公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中 使用5S和16SRNA基因进行PCR扩增，用于菌种的特性鉴定。 已成功地对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株做出鉴定。
16S rDNA序列分析法
具体流程
基因组的制备
PCR克隆16sRNA
阳性克隆鉴定，测序
同源性分析，系统进化树建立
系统发育树
菌种鉴定
制作人：张立岩
内容
简述 16sRNA鉴定菌种
总结
简述
传统的细菌学检验与鉴定的主要依据是形态特征和生理性状,需要进 行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测.方法复杂费时,对有些细 菌也往往不能给出理想的鉴定结果。 诸如引起肺结核的分支杆菌，其生长缓慢，经常要培养几周才能得到 供生物化学分析，鉴定和株系/亚种分型(subtyping)的纯净培养物。 通过传统的培养和生物化学分析方法对其检测和鉴定费时且费用大， 影响医生给予患者最合适的治疗。因为如果不能对细菌进行快速精确 的鉴定，医生只能给患者开广谱抗生素，因而引发无效治疗和细菌耐 药性。
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QY201 Cellulophaga lytica.AB032513
96 100
Cellulophaga sp.AB180390 F*.AJ936938 Cytophaga marinoflava.D12668
根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为Cellulophaga属细菌, 命名Cellulophaga sp.QY201。