菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定流程课件
菌种鉴定是微生物学研究的重要基础工作 ，对于揭示微生物的生态和进化关系、探 索生命科学的基本问题具有重要意义。
02
菌种采集
采集方法
01
02
03
采集方式
根据菌种类型和特性，选 择合适的采集方式，如表 面涂抹、深层挖掘等。
采集工具
根据采集需求，准备适当 的采集工具，如铲子、刀 具、试管等。
采集环境
选择适当的采集环境，如 土壤、水源、动物粪便等 ，并确保环境无污染。
ABCD
稀释分离法
将菌液进行稀释，然后涂布在培养基上，使菌落 分散生长，达到分离纯化的目的。
温度、pH等物理因素分离法
通过调节培养温度、培养基pH等物理因素，使 特定微生物生长繁殖，达到分离纯化的目的。
分离纯化的步骤
采集样品
选择适当的样品，并确保样品无 菌操作。
选择培养基
根据分离的微生物种类选择适宜 的培养基。
采集注意事项
采集安全
在采集过程中，注意个人 安全和卫生，避免交叉感 染。
采集代表性
确保采集的菌种具有代表 性，能够反映该地区的菌 种分布和特点。
采集量控制
根据需求适量采集，避免 过度采集和破坏生态环境 。
采集后的保存
保存容器
选择适当的保存容器，如密封袋 、试管等，并确保容器无菌。
保存环境
选择适当的保存环境，如干燥、阴 凉、避光等，以保持菌种的活性。
和鉴别。
结果分析的注意事项
1 2
准确性
确保鉴定结果的准确性，避免误差和偏差。
完整性
确保鉴定结果的完整性，涵盖菌种的所有相关信 息。
3
可重复性
确保鉴定结果的可重复性，以便于验证和复现。
菌种测定方法范文
菌种测定方法范文菌种测定是对菌种进行鉴定和分类的方法，该方法对于研究微生物的生态学、系统发育学、感染病学以及农业、食品等领域都有重要的意义。
下面将介绍几种常见的菌种测定方法。
1.形态学方法：形态学方法是通过观察菌落形态、细胞形态、胞体结构等特征来对菌种进行鉴定。
该方法需要将菌涂于培养基上进行培养，然后观察菌落的形状、颜色、边缘、质地等特征，并通过显微镜观察细胞的形态、结构等特征。
形态学方法对于一些细菌和真菌有较高的鉴定准确性，但对于一些形态相似的菌种可能存在误判。
2.生理生化方法：生理生化方法是通过观察菌在不同生理条件下的代谢反应、酶活性、碳源利用等特征来对菌种进行鉴定。
该方法通常使用酸碱指示剂、酶、碳源等试剂来观察菌液的变化。
常见的生理生化测试包括氧需求情况、气体产物、酶的产生能力等。
这种方法对菌种的鉴定速度较快，但需要一定的实验技巧和设备。
3.分子生物学方法：分子生物学方法是通过使用DNA序列作为鉴定手段，通过对细菌或真菌的核酸进行特定引物的PCR扩增，然后对PCR产物进行凝胶电泳和序列分析，最后对序列进行比对与分析来对菌种进行鉴定。
这种方法的优势在于高度准确性和灵敏性，并且能够鉴定难培养的菌种。
目前广泛使用的分子生物学方法包括16SrRNA序列分析、ITS序列分析等。
4.免疫学方法：免疫学方法是利用菌种特异性抗原与抗体之间的特异性结合来对菌种进行鉴定。
这种方法的优势在于快速、简单且灵敏度高。
典型的免疫学方法包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验、凝集试验等。
5.生态学方法：生态学方法是通过对菌在自然环境中的分布、多样性、数量等特征进行研究来对菌种进行测定。
该方法通过采集土壤、水体、空气等样品进行分离培养，然后对分离得到的菌属进行鉴定和分类。
生态学方法适用于对环境中的微生物进行研究和监测。
综上所述，菌种测定方法有许多种，包括形态学、生理生化、分子生物学、免疫学和生态学等方法。
不同的方法具有不同的优势和局限性，可以根据研究目的和需求选择合适的方法进行测定。
(完整word)临床分子生物学检验 总
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA)为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1。
菌种鉴定：PCR—测序和PCR—DNA探针杂交;缩短检测时间2。
确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效3.病毒分析:基因型变异产生不同临床症状4。
细菌耐药监测和分子流行病学调查 :随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1。
致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3。
肿瘤相关基因单基因病1。
致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2。
致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2。
疾病诊断和遗传咨询3。
多基因病的研究4。
器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI） 3。
日本国立遗传研究所(DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等.蛋白质数据库常用的有SWISS—PROT、 PIR、 PDB数据库。
addgene质粒鉴定方法 -回复
addgene质粒鉴定方法-回复Addgene质粒鉴定方法引言：在分子生物学实验中，质粒常用于基因克隆、基因表达和遗传转化等研究。
为了保证实验的可靠性和结果的准确性，对于所使用的质粒进行鉴定是至关重要的。
Addgene是一个非营利性的生命科学研究资源库，为全球科学界提供各类质粒。
本文将介绍Addgene质粒鉴定的方法，帮助科研人员准确、可靠地使用Addgene中的质粒。
一、菌种鉴定1. 培养样品中含有质粒的菌株。
Addgene质粒资源库提供的质粒常以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株，因此在使用之前需要确认宿主菌株的鉴定结果。
2. 菌株的培养和扩增。
从低温保存的菌种中挑取一部分菌落，接种到含有适当抗生素的LB （Luria-Bertani）培养基中。
培养至菌落生长形成后，进行菌株的扩增。
3. 菌株鉴定方法。
常见的菌株鉴定方法包括形态特征观察、生理生化试验和分子生物学方法。
菌株形态特征观察主要包括菌落形状、色素产生和荧光等。
生理生化试验则通过菌株对特定试剂的反应，如碳源利用测试、酶活性检测等，来判断菌株的种属。
分子生物学方法则利用特定的引物和PCR扩增技术检测菌株的特定基因片段，进行鉴定。
二、质粒鉴定1. DNA提取将质粒DNA提取出来，可采用常规的DNA提取试剂盒进行提取，也可以使用自制的提取方法。
2. 琼脂糖凝胶电泳将提取的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，通常选择1琼脂糖凝胶进行分离。
加入DNA电泳缓冲液和DNA加载缓冲液后，将DNA样品加载到琼脂糖凝胶孔中，接通电源进行电泳。
3. DNA转印将电泳后的DNA迁移到合适的膜上，如尼龙膜（nylon membrane）或硝酸纤维膜（nitrocellulose membrane）。
4. DNA固定和杂交用含有标记DNA探针的杂交液（例如荧光标记的探针或放射性同位素标记的探针）将DNA固定在膜上，然后在适当的条件下进行固定与杂交。
pcr 鉴定 菌种 试剂盒 原理
聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的技术，用于放大特定的DNA序列。
PCR是一种强大的工具，用于鉴定和表征微生物种类，并且广泛用于微生物诊断和研究。
PCR的一个关键应用是鉴定细菌和真菌物种。
基于PCR的鉴定涉及使用特定引物，这些引物靶向微生物基因组的保守区域，从而使特定物种的DNA序列得到放大。
这使得可以直接从各种样本（如临床标本、环境样本和食品产品）中检测和鉴定微生物。
执行PCR-based鉴定微生物物种时，通常使用专门的试剂盒和试剂。
这些试剂盒通常包含PCR的所有必需成分，包括DNA聚合酶、核苷酸、缓冲液和特定于目标微生物物种的引物。
选择适当的PCR试剂盒对于成功鉴定微生物物种至关重要，因为它确保了PCR反应的特异性和灵敏性。
基于PCR的微生物物种鉴定的原理涉及几个关键步骤。
从样本中提取DNA并纯化以去除可能干扰PCR反应的杂质和抑制剂。
然后将纯化后的DNA用作PCR反应的模板，PCR反应包括多个循环的DNA变性、引物结合和DNA延伸。
这样会放大与感兴趣的微生物物种特异性的目标DNA序列。
PCR-based鉴定微生物物种应用的一个例子是在传染病诊断中。
在临床微生物学中，广泛使用PCR快速准确地检测病原微生物，包括细菌、病毒和真菌，从患者样本中。
基于PCR的鉴定可为临床医生提供有价值的信息，以便及时和有针对性地治疗传染病，从而改善患者的预后。
除了临床诊断，基于PCR的微生物物种鉴定还用于环境微生物学，用于监测和监测各种生态系统中的微生物裙落。
通过鉴定和表征环境样本中存在的微生物物种，研究人员可以深入了解微生物裙落的多样性和功能，以及它们与环境的相互作用。
基于PCR的微生物物种鉴定是一种强大而多功能的工具，在微生物学中应用广泛。
具体试剂盒和试剂的使用，结合PCR的原理，可以准确和敏感地从各种样本中鉴定细菌和真菌物种。
无论在临床诊断、环境监测还是研究中，基于PCR的鉴定在推动我们对微生物多样性及其对人类健康和环境的影响的理解方面起着至关重要的作用。
分子生物学方法鉴定微生物
③ 核酸探针
广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生 物检测以及分子生物学许多领域。 所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的 一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探 针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检 测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的 探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至 更大类群范围的微生物的检测或鉴定。 例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质 粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这 种引起人类性行为传播疾病的细菌。
16S rDNA微生物鉴定流程
培养微生物 提取基因组DNA rDNA序列测定
PCR扩增16S rDNA片段
分析比较
微生物之间的系统发育关系
从样品中分离提取总微生物DNA
从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR 扩增16S rRNA的前提。 一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培 养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的 rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般 多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。
微生物分子生物学鉴定
微生物分类学定义： 按微生物的亲缘关系和进化规律 把它们安排成条理清楚的各种分类单元 或分类群的科学。
微生物的鉴定
主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找 权威性鉴定手册 鉴定方法分四个水平：
1. 细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营 养要求及生长条件等 2. 细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、 光合色素等的分析 3. 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应 等 4. 基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转 化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA 核苷酸序列分析等
乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌分离鉴定及试验方法一、引言乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。
乳酸菌可以通过发酵作用，将葡萄糖、果糖等碳源转化为乳酸和其他有机酸，同时还会产生一些对人体有益的物质，如维生素、酶、抗生素等。
乳酸菌在食品工业、医药工业、农业等领域具有重要的应用前景。
乳酸菌的分离鉴定及试验方法对于深入研究乳酸菌菌种的特性、功能以及在不同领域中的应用具有重要意义。
本文将介绍乳酸菌的分离鉴定及试验方法，旨在为相关研究人员提供参考和指导。
二、乳酸菌分离方法1. 采样乳酸菌的分离首先需要进行采样工作。
可以从发酵食品、乳制品、蔬菜、水果、土壤、肠道等多种来源进行采样。
在采样过程中应注意样品的新鲜性和卫生性，避免外部污染对实验结果造成影响。
2. 培养基的选择乳酸菌可以利用多种培养基进行分离和培养，常用的培养基有MRS培养基、乳清培养基等。
根据具体的分离目的和需求选择适合的培养基。
3. 分离将采样得到的样品进行系列稀释，取适量的稀释液均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，培养温度一般在30-37摄氏度之间，培养时间约48-72小时。
4. 纯化观察培养基上的菌落形态，选择典型的菌落进行分离单菌培养，通过多次传代稀释可以纯化获得纯种的乳酸菌。
5. 形态观察利用显微镜对分离得到的菌株进行形态学观察，包括细胞形状、大小、排列方式等。
三、乳酸菌鉴定方法1. 生理生化鉴定通过对分离得到的菌株进行生理生化特性的研究，包括乳酸发酵能力、氧耐受性、温度、pH值的适应能力等，可以初步判断乳酸菌的种属。
2. 生化试剂法利用生化试剂对乳酸菌进行鉴定，如气体发生试验、氧化还原酶试验、酶活性试验等。
3. 分子生物学鉴定通过PCR扩增乳酸菌的16S rRNA基因序列，测序后与数据库比对，确定乳酸菌的种属分类。
四、乳酸菌试验方法1. 发酵活性测定通过测定菌株在不同条件下的发酵活性，如发酵速率、产酸速率、产酶能力等。
2. 抗菌活性测定测定乳酸菌对一些有害菌的抑菌作用，判断其在抗菌方面的潜力。
免疫组化鉴定菌种的方法
免疫组化鉴定菌种的方法免疫组化是一种常用的实验技术，用于鉴定菌种和研究细胞和组织之间的相互作用。
该技术基于免疫学原理，通过特异性抗体与靶分子结合来检测菌种的存在和特有的生物学功能。
本文将介绍免疫组化鉴定菌种的原理和常见的实验方法。
一、免疫组化原理免疫组化利用抗体与其特异性蛋白质抗原结合的特性，通过荧光染料或酶标记来检测目标分子的存在。
该技术主要包括以下几个步骤：1.样品处理：菌株或细胞培养液通常需要经过固定、包埋或脱水等处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.抗体孵育：将标记有特异性抗体的荧光染料或酶标记与待检测的样品接触，使其与目标抗原结合。
3.清洗：将未结合的抗体去除，以减少非特异性背景信号。
4.信号检测：通过荧光显微镜或酶标测定，观察目标分子的位置和表达水平。
二、免疫组化实验方法1.免疫组化染色法免疫组化染色法是一种常用的实验方法，用于在细胞和组织中检测特定抗原的分布和表达。
该方法可分为直接法和间接法：直接法：将已标记的抗原直接与待检测的组织或细胞接触，然后观察染色结果。
这种方法操作简单、快速，但特异性较差，主要适用于已知抗原的情况。
间接法：通过与辅助抗体结合来增强染色信号的强度和特异性。
首先将待检测样品孵育于特异性抗原的抗体中，然后孵育与特异性抗体结合的辅助抗体，最后使用荧光染料或酶标记的二抗进行检测。
该方法灵敏度高，适用于未知抗原的情况。
2.免疫组化电镜法免疫组化电镜法结合了免疫组化和电子显微镜技术，可用于检测细胞和组织中微小结构的特异性抗原。
该方法主要分为直接法和间接法：直接法：直接将标记有特异性抗体的金或其他金属胶体颗粒与待检测的组织或细胞接触，观察金颗粒在电镜下的位置。
间接法：与免疫组化染色法类似，通过辅助抗体结合来增强信号强度和特异性。
在免疫反应后，使用标记有金或其他金属胶体颗粒的二抗进行检测。
3.免疫组化流式细胞术免疫组化流式细胞术常用于检测细胞表面或细胞内特异的蛋白质抗原。
该方法主要分为两种：直接流式细胞术：将标记有荧光染料的特异性抗体与待检测细胞接触，然后通过流式细胞仪测定细胞的荧光强度和受体数目。
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菌种鉴定的分子生物学方法
——16S rDNA 测序鉴定菌种
一． 原理
细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线
该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：
三． 方法步骤
（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）
1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液
基因组DNA
DNA 提取
PCR 扩增
16S rDNA 片段
片段回收
连接克隆载体
阳性克隆鉴定 测序
2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。
37℃放置10分钟。
4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。
再加入3 μL 蛋白酶K，混匀，55℃温育5分钟。
5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。
9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。
10. 电泳。
取3μL溶液电泳检测质量。
注：如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类，且菌种非常纯净单一，则可以用直接煮沸法。
（二）PCR扩增
1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
27 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492 R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
2. PCR扩增体系：
按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O，建立PCR扩增体系（50μL）
3. PCR
将EP管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。
扩增程序如下为：
4. PCR
拿出EP管，从中取出5 μL反应产物，加入1 μL上样缓冲液。
点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。
电泳30 min。
在紫外灯下检测扩增结果。
（三）扩增片段的回收
根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。
否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。
1. 称量一2mL的EP管质量，记录。
2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2 mL的P管内，称量。
计算凝胶质量。
3．每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer，混匀。
60℃温育至凝胶融化。
4．全部转入UNIQ-10柱中。
10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
5．加入500 μLBinding Buffer，10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。
6．加入70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。
7．再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。
吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。
8．加入30μL预热的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。
12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为回收的DNA片段。
（四）DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为16S PCR引物。
（五）序列比对
将测序的结果在NCBI上进行序列比对，根据比对结果得出鉴定菌种。
*主要仪器：
1. PCR仪（用于进行PCR扩增反应，一般国产价格在2-3万元，最低也要1.8万左右）
2.电泳仪（用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，一般国产几个在3000左右）
附录：实验试剂表。