基因克隆 操作步骤原理及注意事项
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
基因克隆技术的原理与方法
基因克隆技术的原理与方法在人类历史上，基因一直是科学家们探究的热点之一。
随着科技的不断发展，基因克隆技术逐渐被应用于生物医学和生命科学领域，成为这个领域的重要组成部分。
那么，基因克隆技术的原理和具体方法是什么呢？基因克隆技术的原理基因克隆技术是指通过分子生物学技术，将特定的DNA序列复制并扩增，最终得到大量相同的DNA片段的过程。
在这个过程中，使用的主要技术是PCR和DNA重组技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种将小段DNA片段扩增为大量DNA的技术。
它是一种非常高效的DNA复制方法，经过多次扩增可以得到数百万、数千万甚至数十亿倍的DNA。
DNA重组技术是一种将两个不同种类DNA片段组合成一个新的DNA分子的方法。
这个过程通常包括三个步骤：1）通过限制性内切酶切割DNA，得到特定的DNA片段；2）将这些DNA片段与载体DNA序列进行融合；3）通过转化或转染等方法将重组后的DNA引入宿主细胞中，让它开始复制。
利用PCR和DNA重组技术，科学家们可以快速扩增任何一种特定的DNA序列，或者将不同DNA序列进行组合重组，从而高效地制造出人工合成的DNA序列。
同时，这些技术还可实现基因靶向分析、疾病诊断、基因治疗等多种应用。
基因克隆技术的方法通过PCR和DNA重组技术，科学家们可以使用多种不同的方法实现基因克隆。
下面我们就来介绍一些常用的基因克隆方法。
1. 基本的基因克隆方法这种克隆方法包括PCR扩增和限制性内切酶切割，并且可以使用装载体如质粒或病毒来转化宿主细胞。
这种克隆方法常用于基因分析、疾病诊断中。
2. 聚合酶链式反应（PCR）法PCR法是一种基于DNA聚合酶在适当条件下的多次循环扩增DNA片段的技术。
具体步骤如下：将DNA分子用特定的引物扩增引导器识别特定的DNA，然后将扩增反应放到恒温器中进行放大，每循环一次会将扩增的DNA片段分裂成两条链，出现两个新的单链DNA前体，从而实现了DNA聚合。
3. 环状扩增法环状扩增法适用于小片段DNA的克隆，其具体步骤是：用引物识别特定的DNA，然后使用聚合酶以及低成本的环形引物扩增DNA片段。
基因图位克隆的详细流程与注意事项
基因图位克隆的详细流程与注意事项下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!一、引言基因图位克隆是一种用来将感兴趣的基因克隆入载体中，并在目的组织或细胞中进行特异性表达的方法。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
基因克隆实验过程及原理
基因克隆实验过程及原理
1 基因克隆实验
基因克隆实验，又称基因重组实验，是一种现代生物技术，用于实现对特定基因或片段的复制和重组。
它使科学家可以轻松地获得大量有特定功能的指定基因，其应用范围广泛，比如在生物制药，生物材料，检测和分析等领域都得到了广泛应用。
2 原理
基因克隆实验原理遵循真核细胞DNA拷贝过程的三个步骤，即启动子标记，反义RNA转录和DNA合成。
首先，科学家使用RNA引物对特定基因进行标记；其次，采用反义RNA转录酶把特定DNA序列转录成改造过的RNA；最后，科学家运用一种具有修饰活性的DNA聚合酶，利用标记好的RNA模版去合成DNA链。
3 实验过程
（1）前期准备：科学家先要准备出指定基因的克隆载体，即用于携带cloning的分子载体。
可以使用脱氧核糖核酸（DNA）或RNA，来形成一种载体；
（2）克隆箱构建：该实验需要使用一种特殊的形式的克隆箱，即合成给定基因片段的模版，它是基于携带cloning的分子载体；
（3）进行子克隆：根据上述分子载体构建好的给定基因片段，科学家可以利用多种实验方法，将某特定的特定基因片段提取出来；
（4）最后，通过PCR技术放大特定克隆的碱基序列，以实现有效的基因克隆。
基因克隆实验的原理和实验步骤描述非常重要，它不仅减轻了研究人员实验及分析的劳动，而且使得生物制造和医药科研更容易获得大量有特定功能的指定基因。
简述基因克隆的基本过程
简述基因克隆的基本过程
基因克隆是指利用生物学技术进行繁殖某一抗原性基因组片段实现基因复制的过程。
主要由下面几个步骤组成：
一、启动物获取：
1. 从细胞中分离出DNA片段；
2. 使用酶切技术将DNA片段的‘钩子’附加到对应的载体上；
二、基因克隆扩增：
1. 把完美结合的细菌进行培养，促进DNA分子的复制；
2. 使用克隆抗体来处理载体以防止它们散发；
三、基因克隆分离：
1. 使用特定的限制酶进行裂解，将前面复制的DNA分离出来；
2. 使用水和石蜡将克隆体分离；
四、基因克隆实验：
1. 实验研究克隆DNA片段表达的基因；
2. 用PCR微量实验研究克隆体的表达水平；
五、基因突变：
1. 对克隆的DNA片段进行诱变；
2. 使用嵌合子技术将变异的片段插入到载体中；
六、基因表达检测：
1. 检测新插入的基因是否有正常表达；
2. 研究新基因对于抗性或者功能的影响；
七、生成抗原性基因组片段：
1. 用PCR实验研究整个新基因的表达水平；
2. 使用基因合成技术进一步改善新基因的特性；
基因克隆技术的应用有很大的广度，能够有效地增强病原体与病毒的抗体力，提升受抗原抗药的抵抗力，为生物科学的发展提供更多的研究材料。
基因克隆的方法
基因克隆的方法基因克隆是一种将特定的DNA片段从一个组织或生物体中复制并插入到另一个生物体中的技术。
这种技术已经帮助我们研究和理解生命过程的许多方面，包括遗传学、发育生物学和分子生物学等领域。
基因克隆的方法通常包括以下几个步骤：1. DNA片段的提取首先，需要从源组织或生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
这可以通过使用化学物质或机械方法来破坏细胞壁和细胞膜来完成。
然后，可以使用酶切（酶切），即将DNA 分子切割为多个部分，以获取需要的DNA片段。
接下来，需要将目标基因片段插入到载体DNA中，这种DNA通常来自细菌或病毒。
这些载体通常被称为质粒，由于它们可以独立地复制和转移到不同的生物体中，因此它们是进行基因克隆的理想选择。
这个过程的关键是要使用酶切和酶连反应将基因片段和质粒DNA连成一体。
3. 转化完成DNA插入之后，需要将质粒DNA插入到目标生物体中。
这个过程通常被称为转化。
质粒DNA可以通过添加化学物质，电击或热冲击等方法，使其进入目标细胞中。
如果转化成功，则目标细胞将含有与原细胞相同的基因，并且可以将该基因传递给其细胞后代。
4. 克隆筛选最后，需要进行克隆筛选，以确定哪些细胞包含所需的质粒和基因。
可以通过对转化沿用枝接派系进行筛选，这些派系通常包含一些荧光标记或抗生素耐受基因。
这样，只要细胞包含标记，就可以通过添加抗生素来杀死不含标记的细胞，从而将所需的基因克隆出来。
在生物技术的发展中，基因克隆的方法已经得到了广泛应用。
它可以用来生产抗生素、激素和其他药物，也可以用来改变植物和动物的遗传特征，以增加其产量或提高其抗病能力。
基因克隆还可以用来研究基因功能，发现新的基因或揭示遗传疾病的机制。
但是，由于基因克隆涉及到对生命体系进行干预和修改，因此我们必须注意其潜在的风险和不良后果，并确保其在道德和法律方面的合规性和可行性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一：提质粒
1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度
溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时
间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时
3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测
补充：酚氯仿法提取DNA的原理
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,
由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯
酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。
缺
点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。
2.不能完
全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）
用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，
为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表
面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的
上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或
NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷
相斥力，而易于聚集沉淀。
4：酶切
酶切体系：a：鉴定20微升体系Buffer-x 2微升酶1微升质粒2微升（依浓度而定）补水到20微升
b：回收100微升体系Buffer-x 10微升酶-x 3-5微升质粒10微升（依浓度而定）补水到100微升
注意事项：保持质粒的高浓度，确保回收的量酶切一般3小时37℃
5：回收：a：做胶浓度在0.7左右的酶切前先少量点样确定酶切完全，加样100v 1小时左右
b：先在小烧杯里加水煮沸，将切胶的镊子预热，洗干净，切下所需的条带，放到EP管中
c：向EP管中加入400微升的binding buffer 二，在60℃中融化，3000rpm/s 1min 重复三次将离心的液体倒回冲洗离心
d：去除下清，降入500微升的washing solution 洗两次每次用新的洗液 8000rpm/s 30s 再12000rpm/s 2min 去
除残留的液体
e: 加入10微升的Elution Buffer 放入37℃培养箱中10min 结合 12000rpm/s 2min
注意事项：1：保证是新胶新缓冲液浓度大小合适
2：割胶大小要对，割错了后面就白做了，不要割错了条带，这很重要，
3：短波紫外线（254）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体，前者会使以后的链接与转化等实验失败，后者肯能造成基因突变，给克隆工作带来麻烦，波紫外线，回收DNA时也要尽量短时照射，避免连续长时间照射
4：回收时要尽量的柔缓，避免将DNA链弄断
5：做胶时要尽量小薄，回收时割胶尽量少提高回收效率
乙醇对回收的影响较大应注意吸干
Agarose：0.5%：1-30 kb；0.7%：0.8-12 kb
1.2%：0.4-7 kb；1.5%：0.2-3 kb.
六连接
将所回收的小片段与载体(大片段)连接连接体系：小片段：7-9微升大片段：1微升Buffer:2微升
水：9-11微升混匀65℃10min 后加入1微升的连接酶放入16-22℃中过夜，16小时
:
DNA中loading buffer 的作用原理：使DNA粘度增大，不要再点样中被漂离凝胶; 加入的指示剂可指示前沿。
1*的浓度是个经验。
浓度太大，可能产生 DNA和buffer中物质难以分开，拖带；指示剂前沿太宽等适当增加浓度没问题，但没必要。
目的基因的亚克隆
目的基因的亚克隆
所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA 片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
转化
取出感受态细胞放入冰中，加入10左右的质粒放入4度冰箱中30分钟，使质粒吸附在感受态细胞上，在42度下热激80s，冰浴3min 3000rpm 1min 离心去上清加入700微升的LB 放入37度摇床中45-60min 5min 5000rpm 离心去上清剩100微升涂板
冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。
这就是原理。
热激是让已经有孔的大肠杆菌孔膨胀，增加DNA进入的几率，然后立刻冰浴，使孔收缩，进去的DNA不要出来
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在
选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
转化实验时要尽量设立对照组
7：挑菌PCR鉴定
挑菌时每个挑6-10管做PCR鉴定
注意事项：PCR鉴定时要确定不要少加样试剂，因为都是微量加入，所以每次加入时都应注意是否加入试剂，鉴定时常会出现假阳性，即长出斑点的情况，而用PCR鉴定则无法鉴定出来，8：划单克隆鉴定
PCR鉴定，一般可以挑1-3管检测鉴定
9：保种
80%的甘油0.2ml 和0.8ml的菌液用移液管确保无污染。