基因操作常规技术(ppt)
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如果您还记得曾经的“冰 桶挑战”相信大家对称为 渐冻人的罕见病并不陌生， 遗传病种类繁多，疾病患 病后果严重，多数无治疗 方法。每个人携带2.8个隐 性遗传病的致病突变，这 就意味着看似健康的夫妻， 也可能会“非常巧合地” 携带了相同的致病突变， 他们的后代有很大的患病 机率，这些是常规体检无 法检测出来的。遗传病携
康的夫妻，也可能会“非常巧合地”携带了相同的致病突变，
他们的后代有很大的患病机率，这些是常规体检无法检测出
来的。
了解家族致病基因
容易被忽略的基因
多人知道极低密度脂蛋白 （LDL）升高，意味着患 “百米之台，起于垒土”，珍惜身边的 风景， 抓住每 一次机 会，一 步一个 脚印， 阶梯就 有可能 延伸到 远方的 梦和风 景。欣 赏的过 程既要 耐住风 景表面 简单、 重复继 而又复 杂、枯 燥的单 调，又 要感知 蕴藏其 中的可 摸可触 可感的 真水无 香的风 景。身 边的风 景看的 熟了， 更能品 出其中 的真味 。 心脏病的风险增加了。于 是，通常建议这一指标升 高的人，食用更多的蔬菜 水果，减少油脂、胆固醇 的摄入。但是有一类人群 却携带基因突变导致果糖 不耐受，患有此症的人身 体无法完全分解食物中的 果糖，使得有毒代谢物聚 集，尤其在肝脏中（易引 发肝癌）。
01 基因检测主要做些什么
“百米之台，起于垒土”，珍惜身边的 风景， 抓住每 一次机 会，一 步一个 脚印， 阶梯就 有可能 延伸到 远方的 梦和风 景。欣 赏的过 程既要 耐住风 景表面 简单、 重复继 而又复 杂、枯 燥的单 调，又 要感知 蕴藏其 中的可 摸可触 可感的 真水无 香的风 景。身 边的风 景看的 熟了， 更能品 出其中 的真味 。
智商过人
“百米之台，起于垒土”，珍惜身边的 风景， 抓住每 一次机 会，一 步一个 脚印， 阶梯就 有可能 延伸到 远方的 梦和风 景。欣 赏的过 程既要 耐住风 景表面 简单、 重复继 而又复 杂、枯 燥的单 调，又 要感知 蕴藏其 中的可 摸可触 可感的 真水无 香的风 景。身 边的风 景看的 熟了， 更能品 出其中 的真味 。
基因工程育种技术
基因工程育种技术基因工程又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物(受体)，使受体按人们的愿望表现出新的性状。
基因工程诞生于1972年，在其后几年中由于担心重组生物对环境安全的影响，基因工程技术的发展曾一度受挫。
但随着人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行有效的安全性改造，以及相应的DNA重组实验室设计和操作规范的建立，再加上重组DNA技术的巨大应用潜力的诱惑，重组DNA技术迅速发展，现在，基因工程已成为生物学实验室的一项常规技术，并广泛应用于医药、农业、食品、环保等许多领域。
第一节基因工程的基本过程和原理基因工程最典型的操作如图6-1所示一般包括以下三个步骤：1．外源DNA的获得与酶切；2．外源DNA与经同样酶切的载体的连接；3．连接产物转化受体细胞及阳性转化子的筛选；分离D NA酶切酶切供体细胞重组转化子图6-1 基因工程的基本过程由图6-1可见，基因工程操作过程需要以下基本材料：外源DNA(基因)、载体、DNA 体外重组用的酶以及宿主细胞。
一、 载体外源基因导入受体细胞一般都要借助于载体，基因工程中最常用的载体是质粒载体。
图6-2所示pUC19就是最常用的载体之一。
图6-2 载体pUC19及其多克隆位点载体一般含有以下几个基本元件：(一) 复制原点载体在宿主细胞中要独立存在则应具有独立复制的能力，复制原点又称为复制起始位点(Origin，简称ori)，控制载体复制。
不同生物的载体复制原点不同，同一种生物的不同载体拷贝数和稳定性有很大差别，这主要决定于载体的复制原点的性质。
图6-2所示的pUC 系列载体的复制原点是pAM1的一个突变体，在合适的大肠杆菌宿主细胞中(如大肠杆菌JM109)其拷贝数可达500。
整合型载体的复制原点被整合位点的同源序列替代。
(二) 筛选标记一般是载体上的一段编码酶的基因，能赋予转化子新的性状，便于转化子的筛选。
载体pUC19的筛选标记是β-内酰氨酶基因（常简写为bla或Amp r），能分解氨苄青霉素中的β-内酰氨环使其失活，因此在含氨苄青霉素的平板上，只有含质粒的转化子能生长而不含质粒的宿主细胞不能生长。
目的基因.ppt
与RNA聚合酶结合有关 -75区上游有一共有序列GGGCGC (GC框):结合某些转录因子 转录终止区:
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
（3）其他基因组基因的组成
质粒(无内含子) 、 病毒(重叠基因) 、 线粒体(缺少 SD序列) 、叶绿体(多顺反子) 。
一、目的基因的来源 二、获得目的基因的途径
一、目的基因的来源
目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基 因组，特别是人和动植物染色体基因组中蕴藏着大 量的基因，是获得目的基因的主要来源。
结构基因的组成
转录启动区、核糖体识别区、编码区(起译码ATG、ORF、休止码TAG或 TAA或TGA)、终止转录区
（1）原核生物基因的组成
基因区：操纵子。基因之间有间隔序列 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段 SD区：起译码ATG上游约10bp处的富含嘌呤的保守区，其转录物：
5’AGGAGGU3’，核糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置 转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3’ 端提供转录终止信号的 DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。
原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹 。
（2）真核生物基因的组成
基因区：ATG + extrons + introns + TAA（TGA或TAG） 转录启动区：r、m、tRNA分别由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ转录。
编码蛋白的启动子( RNA聚合酶Ⅱ识别)可寻找三个保守区： -20~-30的TATAA/TA区(Hogness框)：解链，决定起录点 -75的9bp共有序列GGT/CCAATCT区(CAAT框)：
（3）应用范围
DNA合成仪
1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因
基因重组方法=全PPT课件
.
23
外源DNA被降解，转导失败。
(2)局限性转导（specialized transduction）
温和噬菌体感染
整合到细菌染色体的特定位点上
宿主细胞发生溶源化
溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上
部分缺陷的温和噬菌体
把供体菌的少数特定基因转移到受. 体菌中
的转化现象
目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力
进行自然转化，需要二方面必要的条件：
建立了感受态的受体细胞
外源. 游离DNA分子
30
枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）
分泌感受态因子
与细胞表面受 体M相互作用
使细胞表面的 DNA结合蛋白 及核酸酶裸露出 来，使其具有与 DNA结合的活 性
b）决定因素也各有不同；
.
34
(2)人工转化
在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。
不是由细菌自身的基因所控制；
用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。
用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。
质粒的转化效率高；
含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株. （F-），细胞表面没有性菌毛7
F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存. 在，也可插入（整合）到染色8 体上
F因子的四种细胞形式
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
.
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
33
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
24
（二）
25
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
15
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
9
• Cre-LoxP系统的特性
讲课基因工程的基本操作程序课件
基因工程的基本操作包括基因克隆、 基因转移、基因表达和基因调控等。
基因工程的历史与发展
01
基因工程的起源可以追溯到20世 纪70年代，当时科学家开始探索 DNA重组技术，奠定了基因工程 的基础。
02
随着技术的不断发展和完善，基 因工程在医学、农业、工业和生 物技术等领域得到了广泛应用。
基因工程的应用领域
安全性和伦理规范。
行业自律
03
相关行业和组织也制定了自律准则和规范，以促进基因工程的
健康发展。
05 基因工程未来展望
基因治疗的发展前景
基因治疗是一种通过修改人类基因来治疗遗传性疾病和获得性病症的方 法。随着基因编辑技术的不断进步，基因治疗在未来的发展前景广阔。
基因治疗将有望治愈一些目前无法根治的遗传性疾病，如囊性纤维化、 镰状细胞贫血等。同时，基因治疗也为一些常见疾病的治疗提供了新的
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增目的基因片段，实现目的基因的快速获取。
化学体构建
载体的选择
目的基因与载体的连接
根据目的基因的特点和基因工程的需 要，选择合适的载体，如质粒、病毒 载体等。
利用限制性内切酶和DNA连接酶，将 目的基因与载体连接成重组DNA分子。
基因歧视
基因工程可能导致基于基因信息 的歧视，影响社会公平。
基因资源保护
基因资源是人类的共同财富，应 避免基因资源被滥用或垄断。
基因工程的法规与监管
国际法规
01
国际社会已经制定了一些关于基因工程的法规和公约，如《联
合国生物多样性公约》和《人类基因组计划宣言》。
国家法规
02
各国政府也制定了相应的法规和监管措施，以确保基因工程的
基因扩增与鉴定
基因工程的历史与发展
01
基因工程的起源可以追溯到20世 纪70年代，当时科学家开始探索 DNA重组技术，奠定了基因工程 的基础。
02
随着技术的不断发展和完善，基 因工程在医学、农业、工业和生 物技术等领域得到了广泛应用。
基因工程的应用领域
安全性和伦理规范。
行业自律
03
相关行业和组织也制定了自律准则和规范，以促进基因工程的
健康发展。
05 基因工程未来展望
基因治疗的发展前景
基因治疗是一种通过修改人类基因来治疗遗传性疾病和获得性病症的方 法。随着基因编辑技术的不断进步，基因治疗在未来的发展前景广阔。
基因治疗将有望治愈一些目前无法根治的遗传性疾病，如囊性纤维化、 镰状细胞贫血等。同时，基因治疗也为一些常见疾病的治疗提供了新的
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增目的基因片段，实现目的基因的快速获取。
化学体构建
载体的选择
目的基因与载体的连接
根据目的基因的特点和基因工程的需 要，选择合适的载体，如质粒、病毒 载体等。
利用限制性内切酶和DNA连接酶，将 目的基因与载体连接成重组DNA分子。
基因歧视
基因工程可能导致基于基因信息 的歧视，影响社会公平。
基因资源保护
基因资源是人类的共同财富，应 避免基因资源被滥用或垄断。
基因工程的法规与监管
国际法规
01
国际社会已经制定了一些关于基因工程的法规和公约，如《联
合国生物多样性公约》和《人类基因组计划宣言》。
国家法规
02
各国政府也制定了相应的法规和监管措施，以确保基因工程的
基因扩增与鉴定
转基因技术——动植物转基因方法ppt(共22张PPT)
【DAWN_ZX】
•优点:不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，
不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握
。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法
逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移
核移植转基因法
体细胞核移植法
线粒体介导法
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用）
【启动子】是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因
转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 【终止子】也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP3：将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞一般用农杆菌转化法，也可 用基因枪法或花粉管通道法。 （2）导入动物细胞一般用显微注射法。 （3）导入微生物细胞一般用感受态细胞吸收DNA 分子的方法。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
。
方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。
方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
•根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目 的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因 向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转 基因植株。 •近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中得到了广 泛应用。
高中新教材生物课件选择性必修基因工程的基本操作程序
生物柴油生产
利用基因工程改良藻类，实现高产油 脂藻类的培养，进而通过酯交换反应 生产生物柴油。这些应用展示了基因 工程在环境保护和能源领域的巨大潜 力。
THANKS
感谢观看
重金属吸附
利用基因工程改造微生物或植物，使其具备吸附重金属的能力，降 低环境中重金属的污染程度。
污染物检测
通过基因工程手段开发生物传感器，用于快速、准确地检测环境中 的污染物。
可再生能源开发中的基因工程技术
生物质能源
利用基因工程改良植物或微生物，提高其生物质产量或改进其生 物质组成，从而更高效地生产生物质能源。
微生物燃料电池
通过基因工程技术改造微生物，使其在特定条件下能够将有机物转 化为电能，应用于微生物燃料电池。
藻类生物柴油
利用基因工程手段改良藻类，提高其油脂产量和品质，进而生产生 物柴油。
实例分析：污水处理和生物柴油生产
污水处理
通过基因工程培育高效降解污水中有 机物的微生物，提高污水处理的效率 和质量。
基因突变筛查
利用基因工程技术检测特定基因突变，预测患病风险，如遗传性 疾病、癌症等。
基因表达分析
通过检测基因表达水平，了解疾病发生发展过程中的基因调控机 制，为疾病诊断和治疗提供依据。
单基因遗传病诊断
针对单基因遗传病，通过基因检测确定致病基因，实现精准诊断 和治疗。
个性化医疗与染植物细胞，将目的基因导 入植物细胞并整合到其基因组中。
基因枪法
花粉管通道法
利用基因枪将带有目的基因的金属微粒直 接射入植物细胞或组织，实现基因转移。
在植物授粉后，利用花粉管作为通道，将 外源DNA导入受精卵细胞，培育出转基因 植株。
转基因动物育种原理及方法
原理
利用基因工程改良藻类，实现高产油 脂藻类的培养，进而通过酯交换反应 生产生物柴油。这些应用展示了基因 工程在环境保护和能源领域的巨大潜 力。
THANKS
感谢观看
重金属吸附
利用基因工程改造微生物或植物，使其具备吸附重金属的能力，降 低环境中重金属的污染程度。
污染物检测
通过基因工程手段开发生物传感器，用于快速、准确地检测环境中 的污染物。
可再生能源开发中的基因工程技术
生物质能源
利用基因工程改良植物或微生物，提高其生物质产量或改进其生 物质组成，从而更高效地生产生物质能源。
微生物燃料电池
通过基因工程技术改造微生物，使其在特定条件下能够将有机物转 化为电能，应用于微生物燃料电池。
藻类生物柴油
利用基因工程手段改良藻类，提高其油脂产量和品质，进而生产生 物柴油。
实例分析：污水处理和生物柴油生产
污水处理
通过基因工程培育高效降解污水中有 机物的微生物，提高污水处理的效率 和质量。
基因突变筛查
利用基因工程技术检测特定基因突变，预测患病风险，如遗传性 疾病、癌症等。
基因表达分析
通过检测基因表达水平，了解疾病发生发展过程中的基因调控机 制，为疾病诊断和治疗提供依据。
单基因遗传病诊断
针对单基因遗传病，通过基因检测确定致病基因，实现精准诊断 和治疗。
个性化医疗与染植物细胞，将目的基因导 入植物细胞并整合到其基因组中。
基因枪法
花粉管通道法
利用基因枪将带有目的基因的金属微粒直 接射入植物细胞或组织，实现基因转移。
在植物授粉后，利用花粉管作为通道，将 外源DNA导入受精卵细胞，培育出转基因 植株。
转基因动物育种原理及方法
原理
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Semi-dry transfer system
4.2.5
斑 点 杂 交
Allele-specific oligonucleotide (ASO) dot-blot hybridization can identify individuals with the sickle cell mutation. The schematic dot-blot at top shows the result of probing with an ASO specific for the normal -globin allele (A-ASO). The results are positive (filled circle) for normal individuals and for heterozygotes but negative for sickle cell homozygotes (dashed, unfilled circle). The dot-blot at the bottom shows the result of probing with an ASO specific for the sickle cell -globin allele (S-ASO), and in this case the results are positive for the sickle cell homozygotes and heterozygotes but negative for normal individuals. The A- and SASO were designed to be 19 nucleotides long in this case chosen from codons 3 to 9 of respectively the sense A and S globin gene sequences surrounding the sickle cell mutation site. The latter is a single nucleotide substitution (A→T) at codon 6 in the -globin gene, resulting in a GAG (Glu)→GTG (Val) substitution (see
• ＞40kb: Rf与分子大小无关 • 改变形状所需时间不同 • 交替改变的电场,线团→束状 • 胶孔中摩擦力不同
A-
B-
+B
+A
A-
-B
B+
+A
脉冲电场电泳示意图
A-
B-
+B
+A
垂直交变电场系统
A-
B-
+B
+A
箝位匀强电场系统
A+B
+A B-
场翻转系统 -
+
旋转胶系统
影响分辨率的因素
• 脉冲时间(0.1s-1000s): 长脉冲,大片段 • 电压: 场强↑,最大片段范围↑ • 电场夹角: 110–120 • 温度: 4℃
4.2.2 Southern杂交
• 质粒鉴定、基因位置、分子诊断
❖酶切和电泳法可以吗?
4.2.3 Northern杂交
• 样品, 电泳, 探针 ❖不宜碱变性 ❖勿低盐buffer洗膜 ❖胶中无EB
4.2.4 Western杂交
• 电泳, 印迹, 免疫学 • 主要步骤 ❖SDS-PAGE, blot ❖杂交(AP或HRP)
4.2 分子杂交技术
• Southern blot • Northern blot • Western blot
• dot blot • FISH • 菌落原位杂交
4.2.1 探针与探针标记
• 寡核苷酸片段 ❖ss or ds ❖足够长度 ❖不含互补区
1. 探针的标记
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
❖位置分布: 沉降速度、MW及离心时间 ❖样品BD = 该位置上的CsCl密度
2. 碱变性法
• pH12: 变性程度 • pH7: 复性速度 • 离心: 收集? • Sol I; II; III
T-DNA ocDNA
D-DNA L-DNA cccDNA
3. 沸水浴法
• 加酶破壁 • 沸水浴40 s • 离心 • Eth沉淀
基因操作常规技术 (ppt)
（优选）基因操作常规技术
4.1 核酸的分离与检测
• gDNA的分离 • 质粒DNA • RNA的分离
4.1.1 gDNA的提取
• 细胞破碎 • 去蛋白
• SDS法 • 酚抽提法
• DNA沉淀 • CTAB法
CTAB法
• 高盐: 溶解 • 低盐: 沉淀 ❖蛋白、多糖分离 ❖NaAc-70% alc
DNase I 5’ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
DNA pol I Mg2+ 5dNTP 5ppp dA(-32P-dATP) 5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’
如何保持CS-DNA的完整性?
• 物理降解 • 内源DNase • ＞pH7
4.1.2 质粒DNA的分离纯化
• 拓扑学的差异 ❖gDNA大, 易解旋 ❖质粒小, ccc状态
1. CsCl密度梯度超离心
❖密度梯度 ❖沉降=扩散 ❖浮力密度差 ❖样品+EB
proteins
ocDNA L-DNA
cccDNA RNAs
荧光素: 罗丹明,FITC 合成法 荧光显微镜
地高辛系统标记
dUT物素标记
Biotin
生色底物 显色酶
GCTTGAGCAGTAACCTG 烷烃连接臂
Avidin
颜色产物
荧光素标记
Biotin GCTTGAGCAGTAACCTG
烷烃连接臂
荧光素 Avidin
缓冲液及其pH
• TBE: 缓冲力大 ❖长 : TAE﹥TBE ❖短: TAE分辨力低
如何防止pH和离子强度改变?
RNA的检测
• A260 • 变性胶 ❖28S→4.5 kb ❖18S→2.1 kb
PAGE
• 尿素 • buffer: 0.51TBE ❖同位素或荧光标记 ❖测序、多态性分析
脉冲场凝胶电泳
随机引物标记
5末端标记
5 HO 3 HO
T4-PNK
5p 3 HO
OH 3 OH 5
Mg2+ pppATP (-32P-dATP)
OH 3 p 5
2. 标记物及其检测
❖放射性标记 ❖非放射性
标记物及性质
标记方法 杂交体检测法
地高辛: DIG
RPL
酶标抗体-底物显色
生物素: Bio-16-dUTP NT,TL,PCR 酶标亲合素显色
凝胶电泳技术
• 分子筛; 电荷效应 • UV→EB→荧光
凝胶成像系统
Rf、分辨力的影响因素
• 大小, 构型 • gel浓度 • 电压、时间 • buffer
凝胶浓度 0.3 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0
片段大小/kb 560 110 0.820 0.58 0.46 0.23 0.12
4.1.3 RNA的提取
• 原理 • 酚-异硫氰酸胍
防止RNA降解的措施
• DEPC处理 • RNasin • 专用无菌台 • 器皿、手套、口罩 • 低温操作
4.1.4 核酸质量检测
• 紫外光谱法 • 荧光分析法 • 凝胶电泳法 • 二苯胺显色
• [ssDNA]=33(A260A310) 稀释 • [dsDNA]=50(A260A310) 稀释 • [ssRNA]=40(A260A310) 稀释