增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较
病理性瘢痕组织内不同部位成纤维细胞的异质性
病理性瘢痕组织内不同部位成纤维细胞的异质性聂芳菲;张哲【摘要】病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,成纤维细胞是其发生、发展的主体细胞.正常皮肤、增生性瘢痕真皮浅层和真皮深层的成纤维细胞以及瘢痕疙瘩组织中不同层次、不同部位的成纤维细胞在细胞形态、功能、分子表型等方面均具有异质性.真皮深层的成纤维细胞可能是形成增生性瘢痕的主要细胞来源;而瘢痕疙瘩的形成则包含了真皮浅层和深层成纤维细胞的共同作用,并与其组织内不同部位成纤维细胞的异质性有关.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)016【总页数】3页(P2892-2894)【关键词】瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;成纤维细胞;异质性;不同部位【作者】聂芳菲;张哲【作者单位】北京大学第三医院成形外科,北京100191;北京大学第三医院成形外科,北京100191【正文语种】中文【中图分类】R622;Q291病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。
两者的实质都是以成纤维细胞为主的细胞增殖、活性增强，产生大量的胶原蛋白，使细胞外基质成分在组织中大量沉积，而难以被机体吸收或重塑的病理状态。
增生性瘢痕表现为高出正常皮肤、质地较硬的皮肤纤维化疾病。
瘢痕疙瘩更是瘢痕形成机制的代表性病变，是整形外科和皮肤科在临床治疗中面临的重大难题。
与增生性瘢痕相比，瘢痕疙瘩的临床特点为创伤诱因不明显、增长速度过快、不易退化、向周围正常皮肤浸润扩散，并超出原皮损范围。
早期常伴有炎性浸润带，手术切除后易复发，且复发范围可超过原瘢痕范围[1]。
在病理性瘢痕发病机制的基础研究中，许多研究者发现，不同层次、不同部位的瘢痕组织在临床表现、病理改变、细胞生物学和分子生物学特性等方面的差异较大，因此采取分层和(或)分部位研究，如真皮浅层和真皮深层；浸润部、增生部和老化部；中央部和周边部[2]。
该文就病理性瘢痕基础研究中关于正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩不同层次、不同部位成纤维细胞的细胞及分子生物学差异作一综述，并探讨瘢痕组织内部成纤维细胞的异质性与病理性瘢痕发病机制的关系。
增生性瘢痕的发病机理和预防进展
增生性瘢痕的发病机理和预防进展增生性瘢痕一直以来都是存在于全世界范围内的难题，在不同种族中其发病率有所差异，以往的报道提到白种人群中的增生性瘢痕发病率在5%～37%[1]。
增生性瘢痕在临床上表现为不超过伤口范围的高出皮肤表面的瘢痕组织，早期充血明显，可伴有疼痛或瘙痒，位于关节部位则可能会引起活动功能障碍[2]。
增生性瘢痕产生的不雅外观和不适症状让患者身心都承受着巨大的压力，预防瘢痕不仅是医学问题，也是一个社会问题，其防治对临床工作者来说更是一个挑战。
本文就增生性瘢痕的预防进展综述如下。
1 发病机制增生性瘢痕的病理基础是以成纤维细胞（fibroblast，Fb）为主的细胞成分的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积，目前其发病机制尚不甚清楚，总结参与的致病因素主要包括以下几个方面：1.1 ECM代谢异常：正常情况下，人体内ECM的合成和分解处于动态平衡，从而维持着相对稳定。
在创伤愈合的过程中，如果ECM合成明显增多则会形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩[3-6]。
Ⅰ型和Ⅲ型胶原是组成ECM的主要成分[7]，在增生性瘢痕中I /III胶原的比例可达6：1，明显高于正常的皮肤组织[8]。
1.2 细胞因子：细胞因子在增生性瘢痕的形成中起到了重要的作用，如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生长因子和胰岛素样生长因子，均可诱导细胞合成大量胶原蛋白，使基质中胶原过度沉积。
Wang[9]研究发现增生性瘢痕比正常皮肤产生更多的可合成TGF-β1的mRNA以及蛋白，并且持续高表达TGF-β受体。
1.3 低氧和自由基：Takahashi等[10]发现低氧环境中培养的Fb可持续高表达脯氨酸、胶原蛋白，而间质金属蛋白酶-3表达降低，导致创伤后胶原沉积[11]。
研究表明，高于正常水平的NO可刺激成纤维细胞合成胶原，与瘢痕的形成有关[12]。
病理性瘢痕基因治疗的研究现状通
病理性瘢痕基因治疗的研究现状通（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【关键词】增生性瘢痕;瘢痕疙瘩;基因治疗;细胞因子病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前国内外的研究尚未能很好地揭示其发病机制，临床防治也存在较大困难，成为了医学研究的难点和重点问题之一。
近年来，随着基因工程技术的研究进展，病理性瘢痕的基因治疗成为研究的热点，现就其研究现状综述如下。
1 细胞因子基因疗法目前的研究表明，各种细胞因子对创面愈合和瘢痕防治的作用不同，通过基因转染、基因敲除等手段，针对这些细胞因子的作用进行干预，可以达到防治瘢痕的目的。
1.1 转化生长因子β(TGF-β) TGF-β在瘢痕形成及发展中起着非常重要的作用[1]。
Choi等[2]以反义TGF-β1核酸转染动物伤口，结果发现在给予反义寡核苷酸转染抑制TGF-β功能后，伤口瘢痕形成显著减少。
liu等[3]用含有截短型TGF-βⅡ型(tTGF-βR Ⅱ)受体的腺病毒转染新生大鼠背部线性伤口，检测结果表明腺病毒介导的tTGF-βR Ⅱ可促进创伤愈合，减少瘢痕形成。
Ashcroft等[4]证实Smad3 缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成减少。
Gao等[5]证实针对Smad 2的小干扰RNA转染能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞的I、Ⅲ型胶原分泌。
提示通过对TGF-β下游分子Smad进行干预，也能对抗TGF-β促瘢痕形成作用。
1.2 肝细胞生长因子(HGF) HGF可抑制肝纤维化组织中TGF-β1的产生，增强胶原酶的活性。
Ha 等[6]以腺病毒载体将人的HGF 转染兔耳增生性瘢痕，结果显示实验组瘢痕明显缩小，胶原成分也较对照组减少，而且有更多的毛囊和汗腺结构出现。
1.3 结缔组织生长因子(CTGF) CTGF在肝、肾、等器官纤维化中具有重要作用，是TGF-β的下游分子，能促进成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的表达[7]。
刘剑毅等[8]以脂质体将CTGF反义寡核苷酸导入瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)，证实CTGF反义寡核苷酸能抑制细胞增殖，减少其胶原合成。
皮肤瘢痕疙瘩实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本研究旨在探讨皮肤瘢痕疙瘩的形成机制及其治疗方法，通过实验验证相关理论，为临床治疗提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）实验动物：健康SD大鼠30只，雌雄各半，体重200-250g。
（2）实验试剂：兔抗鼠胶原蛋白抗体、兔抗鼠转化生长因子-β1（TGF-β1）抗体、兔抗鼠血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）抗体、免疫组化试剂盒、苏木精-伊红（HE）染色试剂盒等。
（3）实验仪器：光学显微镜、激光共聚焦显微镜、凝胶成像系统、生物组织切片机等。
2. 实验方法（1）建立皮肤瘢痕疙瘩模型：选取10只SD大鼠，采用背部手术方法制造皮肤瘢痕疙瘩模型，另一组10只作为对照组。
（2）实验分组：将模型组分为A、B、C三组，分别采用以下治疗方法：A组：采用局部注射糖皮质激素（得宝松）治疗；B组：采用局部注射5-氟尿嘧啶治疗；C组：采用局部注射利多卡因和曲安奈德混合液治疗。
对照组采用安慰剂治疗。
（3）组织学观察：在治疗结束后，取实验动物背部皮肤组织，进行HE染色和免疫组化检测。
（4）统计学分析：采用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和最小显著差异法（LSD）进行多重比较。
三、实验结果1. 组织学观察（1）对照组：皮肤组织结构正常，无瘢痕疙瘩形成。
（2）模型组：皮肤组织出现明显的瘢痕疙瘩，胶原纤维过度增生，细胞排列紊乱。
（3）A组：皮肤组织结构基本恢复正常，瘢痕疙瘩明显减轻。
（4）B组：皮肤组织结构基本恢复正常，瘢痕疙瘩减轻程度与A组相似。
（5）C组：皮肤组织结构基本恢复正常，瘢痕疙瘩减轻程度与A组相似。
2. 免疫组化检测（1）对照组：胶原蛋白、TGF-β1、PDGF-BB表达水平正常。
（2）模型组：胶原蛋白、TGF-β1、PDGF-BB表达水平明显升高。
（3）A组、B组、C组：胶原蛋白、TGF-β1、PDGF-BB表达水平均显著降低，与模型组相比差异具有统计学意义。
BSG在医药中的分析情况
BSG在医药中的分析情况引言白芨葡甘聚糖(BSG)是由白芨(Bz以iz如s￡，．谊f口(Thunb．)Reichb．f．)的假鳞茎部分提取出来的生物多糖大分子‘1|。
白芨中还含有淀粉、二氢菲类化合物嘲、芪类化合物等‰引。
《神农百草经》中称，白芨“味苦平。
主痈肿，恶创，败疽，伤阴，死肌，胃中邪气，赋风，鬼击。
痱缓，不收。
一名甘根，一名连及草。
生川谷。
……”民间常用白芨治疗痈疽肿痛、创伤止血、手足皲裂等症。
白芨葡甘聚糖是一种由葡萄糖和甘露糖组成的中性杂多糖。
不同来源的白芨样品中所含BSG的分子量有很大差别，分子中葡萄糖(Glu)残基和甘露糖(Man)残基的摩尔比也有所不同。
芮海云等认为BSG是由p(1—4)一甘露糖、p(1—4)一葡萄糖和口一(卜6)葡萄糖残基组成，它们的摩尔比约为6．8s4．7t1．5，重均分子量约为99．658ku5。
wang等通过高效液相色谱分馏，得到多糖含量达到96．9％(w／w)的BSG样品，分子量约为135kDa6。
他们认为BSG分子中Man和Glu的摩尔比约为2．4：1，并推测BSP分子的可能结构为一3)-口一Man户(1—4)廿Man户(1一。
4十1pGlu户悦随士等详细研究了BSG的毒性7。
通过静脉注射、腹腔注射和灌胃三种途径，给昆明种小白鼠使用BSG。
结果表明小鼠尾静脉注射的LD50为595mg／kg，腹腔注射的LD50为804mg／kg，灌胃的最小致死量>2000mg／kg。
在家犬身上进行局部毒性试验，BSG对肝、脑、皮下组织等无明显刺激性，不诱发感染性炎症、不影响创口愈合，组织吸收较快，利于创口愈合。
张卫明等对BSG的皮肤毒理学安全性研究也表明。
BSG对皮肤无刺激，无变态性反应和光毒反应，对人体皮肤无明显不良反应8。
因此，BSG用于医药和日化原料是安全的。
随着中医药学的发展，白芨在临床上的应用范围持续放大，给药途径更加多样化。
除了直接以白芨粉或白芨假鳞茎入药，还直接将BSG 应用于医学研究和临床治疗。
脂多糖对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞增殖及I、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响
一
个体相同代数 的瘢痕组织成 纤维细胞作对照。结果 与对照组 比较 ，０ ０ ． ５～０５０ ０ ． ｒ 组 值增加 ，于 ５～键词 】 脂 多糖 ；细胞 增殖；信使核糖核 酸；成 纤维细胞 ；增生性瘢痕
中 图分 类 号 ：Ｒ １ ：Ｑ １ ３ ８ ８３ 文献 标 识 码 ：Ａ ｄ ｉ ０３３ ６ｉ ｎ１７ — ６ ９２ １ ． ．１ １ ｏ １ ． ６ ．ｓ．６４ ４ ５ ． １ ２０ ６ ： ９ ｓ ０ ０
Ｉ ｆ ｅ ｃ ｆＬ ｐ ｐ ｌｓ ｅ ｈ ｒｄ ｎ ｔ ｅＰｒ ｌ ｅ ａｉｎ ａ ｄ ｔ ｅｍ ＲＮＡｓＥｘ ｒ ｓｉｎ ｏ ｒ ｃ ｌ ｇ ｎ Ｔｙ ｅＩ．Ⅲ ａ ｄ Ｃｏｌｇ ｎ ｓ ｎ ｕ ｎ ｅｏ ｉｏ ｏｙ ａ ｃ ａ ｉｅ ｏ ｈ ｏｉ ｒ ｔ ｎ ｈ ｌ ｆ ｏ ｐ ｅｓｏ ｆＰ ｏ ｏｌ ｅ ｐ ａ ｎ ｌ ｅ ａｅ ａ
意义 （ ０ ５ ；１ ０ ￣ ／ Ｊ Ａ值降低 ，于 ３～９ｄ差异有统计 学意义 （ ０ ５ 。与对照组比较 ，００ ５～Ｏ５０ ， ｍ 组细胞 Ｐ＜ ． ） ． ０ ｇ ｍ 组 ０ ０ Ｐ＜ ． ） ０ ． ０ ．０ ￣／ ｌ ｅ
数量显著增加 ，于 １ ～６ｄ差异有统计学意义 （ ０ ５ ；１ ０ ｎｌ Ｐ＜ ． ） ． ０ ０ ０ １组细胞数量显著降低 ，于 ２～９ｄ差异有统计 学意义 （ ｏ ５ 。 Ｐ＜ ． ） ０
与对 照 组 比较 ，００５～Ｏ５０ ． ０ ． ０ ｍ１ 促 进 细 胞胶 原合 成 ，且 Ｏ１ ０ 组 ． ０ ｒ１ 作 用 达 高峰 （ Ｏ ５ ，１ ０ ｇｍｌ Ｐ ｎ组 Ｐ＜ ． ） ． ０ ｔ／ Ｓ抑 制 细 胞胶 ０ ０ ｔ Ｌ
结缔组织生长因子与瘢痕
结缔组织生长因子与瘢痕皮肤瘢痕本质上是一种皮肤伤口的病理愈合过程,其最显著的特征是成纤维细胞持续活化所产生的细胞外基质(ECM)成分,如纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖，尤其是胶原的过度堆积,导致真皮的纤维化。
尽管目前尚不清楚瘢痕的发病机制,但在伤口愈合过程中由血小板以及各种炎症细胞释放的细胞因子被认为在瘢痕的发生、发展以及转归中起着关键的作用。
近年来在瘢痕形成过程的发病中，细胞因子网络逐渐为人们的研究热点,其中转化生长因子β(TGFβ)被认为是具有致纤维化作用的重要细胞因子之一。
结缔组织生长因子(CTGF)是一种新发现的细胞因子，被视为转化生长因子β1(TGFβ1)的下游反应元件，具有促进成纤维细胞增殖以及参与细胞外基质(ECM)产生、积聚等功能，这在多种纤维化疾病的研究中已得到证实。
在瘢痕形成过程的体内和体外实验研究中,CTGF对成纤维细胞的分化增殖，具有很强的调控作用，而CTGF的异常高表达在瘢痕形成过程的发生、发展过程中起着关键作用，已成为瘢痕形成过程新的研究热点[12]，本文就这方面的研究文献作一综述。
1CTGF分类与结构1991年Bradham等[3]首先在人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的条件培养基中发现了人类的CTGF(hCTGF)。
它是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽，是一种单基因生长因子，归属于以其命名的家族，这个家族成员在氨基酸序列上有着高度的同源性，目前其成员包括了cyr61(cysteine rich61)、CTGF、nov(nephroblastoma overxpressed gene)、elml/wisp1(expressed low in metastasis1)、CTGFL(CTGF like)/wisp2和wisp3等七种细胞因子,均已被提取、克隆和测序。
虽然它们结构相似,但功能却有显著差异。
如cyr 61和CTGF具有趋化细胞、促进细胞粘附、增生和ECM合成等作用;而nov、elml、CTGFL 和wisp3对细胞增生却表现为负性调节作用[4]。
病理学瘢痕组织的名词解释
病理学瘢痕组织的名词解释病理学瘢痕组织是指在肌体组织受到创伤或炎症等损伤后，经过修复过程形成的一种特殊结构。
瘢痕组织与正常组织相比，具有明显的差异，呈现出较低的弹性和柔韧性。
本文将以病理学角度解释瘢痕组织的形成过程、结构特点以及与疾病相关的因素。
1. 瘢痕组织的形成过程瘢痕组织的形成是机体对受伤组织进行修复的过程。
当组织受到创伤源或炎症的刺激时，机体会迅速启动修复机制。
在修复过程中，炎症细胞可清除坏死组织和炎性渗出物，同时刺激和激活纤维母细胞。
这些纤维母细胞会合成胶原蛋白和其他细胞外基质分子，形成初级瘢痕。
随后，初级瘢痕会逐渐重塑为成熟的瘢痕组织。
2. 瘢痕组织的结构特点瘢痕组织与正常组织结构明显不同。
正常组织由许多细胞类型和细胞外基质组成，而瘢痕组织则主要由胶原蛋白和较少量的弹性纤维构成。
这使得瘢痕组织相对较僵硬，缺乏正常组织的弹性和柔韧性。
此外，在瘢痕组织中，细胞数量相对较少，而胶原纤维则更为密集，并呈现出排列有序的纤维束结构。
这种结构导致瘢痕组织的稳定性和抗张力能力较强。
3. 瘢痕组织与疾病的关系瘢痕组织的存在与许多疾病息息相关。
一方面，过度的瘢痕形成会导致瘢痕疙瘩（Keloid）的产生。
瘢痕疙瘩是一种过度增生的瘢痕组织，其特点是生长较大、呈现红色或暗黑色、瘙痒等症状，严重影响患者的外貌和生活质量。
另一方面，某些疾病也会导致瘢痕组织的缺陷。
例如，肝硬化、肾脏病等疾病可引起瘢痕组织的过度沉积，导致组织结构紊乱和器官功能受损。
4. 影响瘢痕组织形成的因素瘢痕组织形成的过程受到多个因素的调控。
首先是创伤的性质和严重程度。
较大的创伤面积和深度通常会导致更明显的瘢痕形成。
其次是个体差异和遗传因素。
一些人可能对瘢痕形成更为敏感，易于形成瘢痕疙瘩。
此外，机体内的生长因子和细胞因子，如胰岛素样生长因子（IGF）和转化生长因子β（TGF-β），对瘢痕组织形成也有重要调控作用。
总结而言，病理学瘢痕组织是损伤修复过程中形成的一种特殊结构。
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论著【收稿日期】2004-10-12;【修回日期】2004-12-03【作者简介】李卫华(1971-),男,籍贯河北,硕士,主治医师,主要研究方向为瘢痕的形成机理。
增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞生长差异比较李卫华1,李德水2,刘洪琪2(武警医学院:11整形美容中心;21烧伤整形科;天津300162)摘 要: 【目的】探讨增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞基因表现型的差异以及EGF 、PD GF 和bF GF 对其的影响。
【方法】测定细胞生长曲线;应用液闪计数测定成纤维细胞胶原蛋白的合成。
【结果】增生性瘢痕成纤维细胞增殖速度比正常皮肤成纤维细胞慢;胶原蛋白的合成高于正常皮肤成纤维细胞。
EGF 、PD GF 和bF GF 均对两种成纤维细胞的增殖具有强烈的刺激作用。
EGF 和bF GF 可减少增生性瘢痕成纤维细胞的胶原蛋白合成,PD GF 可以使两种成纤维细胞的胶原蛋白合成增加。
【结论】增生性瘢痕成纤维细胞是一种特殊基因表现型的成纤维细胞,它具有自己特殊的生物学特性。
EGF 、PD GF 和bF GF 在增生性瘢痕的形成过程中可能具有重要作用。
关键词:增生性瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白;表皮细胞生长因子;血小板衍生生长因子;碱性成纤维细胞生长因子【文章编号】 100825041(2005)022******* 【中图分类号】 R32912 【文献标识码】 AThe study of the phenotypic differences of hypertrophic scar f ibroblasts versus normal dermal f ibroblasts by cytokine stimulationL I Wei 2hu a ,L I De 2shui ,L IU H ong 2qi (Department of Plastic and Esthetic Surgery ,The A ff iliated H ospital of Medical College of Chinese People ′s Armed Police Force ,Tianjin 300162,China)Abstract :【Objective 】To study the phenotypic differences between the hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts by determining their responsiveness to EGF 、PD GF and bF GF 【Methods 】Hypertrophic scar fibroblasts and normal dermal fibroblasts were propagated in culture.Their proliferative behaviors were studied.The collagen synthetic rates were determinedwith liquid scintillation technology.【R esults 】Hypertrophic scar fibroblasts grew at a lower rate than that of normal dermal fibrob1asts.The collagen synthetic rate of the hypertrophic scar fibroblasts was higher than that of the normal dermal fibroblasts.EGF 、PD GF and bF GF stimulated the proliferation of both cells violently.The col1agen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts was inhibited by EGF and bF GF whereas PD GF increased both cells ′collagen synthesis.【Conclusion 】The hypertrophic scar fibroblast is a different phenotype from the normal dermal fibrob 2last.EGF 、PD GF and bF GF may play important roles in the formation of hypertrophic scars.K ey Words :Hypertrophic scar ;Fibroblasts ;Collagen ;EGF ;PD GF ;bF GF 增生性瘢痕一直是限制患者正常愈合的一个主要问题,其病因尚未完全明了。
Worrall 1的研究结果显示将正常皮肤成纤维细胞长期暴露于可溶性单核细胞提取物的环境中可使成纤维细胞发生红斑狼疮样基因表现型改变。
G arner 2的研究结果揭示增生性瘢痕成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞可能具有不同的基因表现型。
为了进一步明确增生性瘢痕成纤维细胞基因表现型,我们应用体外细胞培养技术研究了增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞的形态、生长曲线以及胶原蛋白的合成,并就表皮细胞生长因子(EGF )、血小板衍生生长因于(PD GF )和碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )对增生性瘢痕成纤维细胞的作用进行了研究。
1 材料与方法111 材 料11111 主要试剂:DM EM低糖型培养基由美国GIBCO公司生产,胎牛血清由中国医学科学院血液学研究所生产,EGF、PD GF、bF GF、粗制Ⅰ型胶原酶、离解蛋白DispaseⅡ、胰酶、N EM、Ⅶ型胶原酶、POP、POPOP、TritonX2100均由美国Sigma公司生产。
β2氨基丙腈由上海生化公司生产,3H2脯氨酸(1mCi/ml)由北京原子能所生产。
11112 实验器材:超净工作台由北京半导体设备一厂生产,CO2培养箱由日本Sanyo公司生产,倒置相差显微镜由日本Olympus公司生产,液闪计数仪由美国Bickman公司生产。
11113 标本的采集:本组10例标本取自住院患者手术时切除的增生性瘢痕(经病理组织学检查确诊),同时在植皮时获取患者剩余的正常皮肤。
患者无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病,无心、肺、肝、肾等慢性疾病,3m内未使用过类固醇激素、青霉胺、抗肿瘤药物等,且未接受过放射线治疗。
本组男7例,女3例,年龄6～42岁,瘢痕为烧伤后8m～3年,瘢痕凸出于皮肤表面,发红,痒、痛症状明显,因此可以确定瘢痕处于增生活跃期。
112 方 法11211 成纤维细胞培养:我们采用消化法来进行成纤维细胞的原代培养。
所得标本切除皮下脂肪组织,置于含青霉素和链霉素各100Iu/ml的DM EM 培养基中。
2h后将组织标本浸于25%DispaseⅡ中,置于37℃条件下作用2h,完整撕下表皮层。
真皮组织用PBS缓冲液反复冲洗后,剪切成1～2 mm的小块,加入30～50倍体积1mg/ml粗制Ⅰ型胶原酶,于37℃条件下继续消化2～4h。
边消化边振荡,随时在显微镜下观察消化结果。
当成纤维细胞大部分从包裹的胶原纤维中分离出来时,用100目不锈钢网过滤,去除大的组织块残渣,滤液离心,去除上清液,细胞计数后以(1～2)×105细胞/25ml培养瓶接种,以后每隔3d换1次培养液。
待细胞融合后,用胰酶消化后传代。
实验所用细胞为体外培养3～5代细胞。
11212 细胞生长动力学研究:实验分为正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组。
以104细胞/孔接种细胞于96孔培养板上,每组24孔,对照组加入含014%FCS的DM EM培养基。
实验组每组分别加入8ng/ml EGF、4ng/ml PD GF和4ng/ml bF GF的含014%FCS DM EM培养基,分别于细胞接种后第3、6、9、12d进行细胞记数。
每次每组选取6孔细胞进行记数。
最后绘制细胞生长曲线。
11213 胶原蛋白合成的测定:实验分为空白对照组、正常对照组、EGF组、PD GF组和bF GF组,每组8孔。
以105细胞/孔分别接种增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞于24孔培养板上,每孔加入1ml含8%FCS的DM EM培养液。
分别于72、96h后去掉原培养液,加入014%FCS的DM EM培养基。
120h后实验组每孔加入含有设定浓度的EGF、PD GF、bF GF和50μg/ml抗坏血酸钠的DM EM培养基。
168h后加入3H标记的脯氨酸和β2氨基丙腈,使其最终浓度分别为5μCi/ml 和80μg/ml。
192h后,根据Postlethwaite3的方法分别收集两份上清液,每份均为015ml。
一份上清液用于总蛋白含量的测定:在收集到的上清液中加入70μl012M Tris/013MCaCl2缓冲液(p H715),25μl FCS,30μl50mM N EM,75μl50%三氯乙酸/0175%鞣酸混合液,在4℃条件下静置30min,将析出的蛋白过滤到玻璃纤维滤膜上,25℃条件下隔夜烘干,置于闪烁液中进行液闪计数。
另一份上清液中加入20μl纯化的细菌胶原酶(用Sephadex G2200凝胶柱过滤去除蛋白酶4),37℃孵育90min以去除胶原蛋白,剩余的蛋白进行液闪计数即为非胶原蛋白的量。
最后用总蛋白的量减去非胶原蛋白的量,即为胶原蛋白的含量。
最后结果以液闪计数cpm/105细胞表示。
11214 统计学处理:每组标本均数间的比较用t 检验进行统计学处理。
2 结 果211 细胞生长动力学测定结果通过细胞生长动力学测定,发现增生性瘢痕成纤维细胞倍增时间约为6d,而正常皮肤成纤维细胞倍增时间为3d,细胞发生融合时前者的细胞数为(114±015)×105,远远少于后者的细胞数(215±018)×105,仅为后者的56%,两者之间具有明显的差异(P <01001)。
而EGF 、PD GF 、bF GF 对两种成纤维细胞均具有明显的促进增殖作用。
在这三种生长因子的作用下,细胞的倍增时间缩短,细胞融合后细胞数明显增多(图1)。
图1 增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞生长曲线212 细胞胶原蛋白合成测定结果增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的量为(614±113)×103cpm/105细胞,正常皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的量为(311±019)×103cpm/105细胞,增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的量明显高于正常皮肤成纤维细胞(P <01001)。