第六章 人工染色体

• F因子具有携带 1Mb插入片段的潜能，这就使构建具有大 容量克隆能力的载体成为可能 • 将 F 因子经基因工程改良构成的 BAC 载体，可用于克隆 100 kb以上的DNA片段。

带有外源片段的 BAC 载体在细菌细胞（ 重组缺陷型， rec－） 中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子在细胞内
二、人类人工染色体

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1 、自上而下的策略：是以天然染色体的断 裂片段为基础，构建新的HAC 这些断裂片段主要通过以下方法得到 (ａ)低剂量辐射 (ｂ)端粒定位染色体截断技术 (ｃ)外源性ＤＮＡ片段定点插入后扩增 (ｄ)天然染色体有丝分裂过程中自发形成


将外源性端粒ＤＮＡ整合入哺乳动物染色体,可将该染色体截断,同时 在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体， 成功构建了一系列大小在 0.5 ～ 6Ｍｂ之间不等ＨＡＣ。最初，端粒 ＤＮＡ整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒ＤＮＡ 定点插入染色体中特定的位点。



P1衍生人工染色体
总结
第一节 YAC——酵母人工染色体
一、YAC的基本序列元件
酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS） 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN） 酵母染色体的端粒顺序（TEL）
YAC
载体主要是用来构建大片段 DNA ，特别用 来构建高等真核生物的基因组，并不用作常规的 基因克隆。
第六章 人工染色体

生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生
化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与
成百至上万千碱基的DNA片段相关。

复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也
涉及到大片段DNA的研究。

因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的
重要发展方向之一。

随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的 日 益深入 ， 对可 插入大 片段 DNA 的克 隆 载 体——人工染色体的研究取得了迅速的发展


YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响 了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿 酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相 近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。
第二节 细菌人工染色体（BAC）
一、BAC特点 1、是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高通量低

2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段， 可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC 3 、酵母作为一种真核生物，为其它真核的 DNA提供了更合适的环境

四、 YAC克隆系统的缺点

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首 先 ， 在 YAC 载 体 的 插 入 片 段 会 出 现 缺 失 （ deletion ）和基因重排（ rearrangement ）的现 象。 其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的 插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。 嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。

P1噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含 相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外
包装于P1壳内。P1进入宿主细胞后环化，扩增。

1994 年，有人将 P1 和 F 因子克隆结合产生 P1 人
工染色体克隆系统-----PAC。
• 基于 PAC 的 人类基因组文 库插入片段的 大小在 60kb～ 150kb 之间。
二、克隆策略

YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限
制性内切酶酶解后变成大片段 DNA，克隆进 根据标记性状筛选出重组的人工染色体
酵母载体 DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，
三、YAC克隆系统的特点

1 、 YAC 作为可提供大片段 DNA 的方法，简 化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基 因的过程（200～500kb，甚至1000kb）
变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1
基因的突变效应，形成正常的白色菌落。

由于酵母的染色体是线 状的，因此其在工作状 态也是线状的。但是， 为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的方式 存在，并增加了普通大 肠杆菌质粒载体的复制 元件和选择标记，以便 保存和增殖。
（2）自下而上的策略 • 该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒ＤＮ Ａ、端粒ＤＮＡ以及复制起点装配在一起，从 而构建HAC。

研究者应用这种策略，在ＨＴ1080细胞中得到了第 一种ＨＡＣ。
他们将 >1Ｍｂ的人 17号染色体的 α卫星ＤＮＡ、人 端粒ＤＮＡ、人基因组ＤＮＡ随机片段用脂质体共 转染ＨＴ1080细胞。

BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合 及重组现象少 可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便 快捷 BAC 载体在克隆位点的两侧具有 T7 和 SP6 聚合


酶启动子，可以用于转录获得 RNA 探针或直接
用于插入片段的末端测序
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第三节 其他的人工染色体
一、P1人工染色体克隆系统-----PAC

所谓人工染色体 —— 是一类能在生物细胞中 独立 “ 稳定存在和遗传的人工重组 DNA 分子 ” 。
现正在研究的人工染色体

酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC，1000kb） 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC，300kb ） 哺乳类人工染色体（MAC）
E. coli
E. coli E. coli
酵母细胞
哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
环状
环状 环状 线性染色体
35- 45kb
≈300 kb 100 - 2000 kb
100 - 1000 kb
〉 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
线性染色体 环状 环状


经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点 且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色 体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正 常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而 丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出ＨＡ Ｃ。
载体的种类和特征
受体细胞 质粒 λ 噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8kb 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列，λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1
拷贝的质粒载体。
2、F因子的特点

又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体 中。并能高频率的转移遗传标记。 F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一 般为每细胞 1～ 2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外 源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC 中外源基因的重组和嵌合度



lacZ 基 因 － 颜 色 鉴别重组子，外源 基因插入

Cre/loxP ： 来 自 P1 噬 菌 体 ， Cre 重 组 酶 基 因 和 loxP 序 列位于 P1 噬菌体基 因 组 内 ， loxP 是 Cre酶的识别序列

利用Cre/loxP直接构建外源基因的限制酶谱
人工合成的进行末端标记的含 有loxP序列的片段
E. coli E. coli E. coli
粘粒载体
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome) YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
• F 因 子 的 parA，parB，
parC 基 因 以 保 证 低 拷 贝 的BAC质粒在大肠杆菌分
裂时均匀分配到子代细胞
• oriS 基因：来源于大肠
杆菌 F 因子（致育因子）
的严谨型控制的复制子

解旋酶基因－ repE ：一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋 酶 选择标志基因Cmr－氯霉素抗性 基因 cosN— 来源于 λphage 的 cos 位 点，可以用 λ末端酶切割 BAC使 之线性化 NotⅠ识别序列，位点十分稀少。 重组子通过 NotⅠ消化后，可以 得到完整的插入片段。
稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的DNA大分子

克隆350kb
二、BAC载体的结构

1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯 霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131） 基础上构建了第一代BAC人工染色体。能
够克隆和保持大于100kb的DNA。
•新一代BAC载体为7.4kb
的环状质粒：
练习题

Байду номын сангаас
已知基因a的表达产物是一种酶A，已知这种酶 A具有几个保守位点，请考虑如何从基因组中 扩增基因a，并实现体外高效表达？需要使用 的质粒载体有哪些？酶切位点如何选择？
酶A
保守区1
保守区2
保守区3
正常酵母人工染色体含
有：
*四膜虫端粒（tel） 定位于染色体末端一段 序列，用于保护线状的 DNA 不被胞内的核酸酶
降解，形成稳定的结构

酵母自主复制序列（ARS) 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进 行双向复制所必需的信号。

酵母着丝点 (CEN)
有丝分裂过程中纺锤丝 的结合位点， 使染色体 在分裂过程中能正确分 配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内 只有一个人工染色体的 作用。