07第七章 亲和层析
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度 对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。 增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相 应增加(见表7-5)。
第七章 亲和层析
一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的 主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。 缺点： 由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物 质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终 收得率却甚低。
1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法，并成 功地制备了固定化酶。 这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯 化的方法，于20世纪70年代就有了惊人的发展，并逐 步得到了广泛的应用。 这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速 和高效(见表7-1)。
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
第二节 操
作
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响；
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理 在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当 长 度 的 “ 手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架， 或许可以 减少基质的立体位阻 效应， 增加配体的活动度 , 伸入溶液的深度, 从而提高吸附剂的操作 容量。
因此，Sepharose 4B成了亲和层析中广泛使用的一种 基质。
二、配体的选择 可选择的配体有： 抑制剂、 效应物、 酶的辅助因子、 类似底物、 抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)蛋白质复合物抗体]、 其他物质(如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金 属离子)等。
优良的配体须具备两个条件： 1）与纯化的物质有较强亲和力 一般来说， 配体对大分子物质的亲和力越高(即Ki（抑制常数）或 Ka（解离常数） 较小)，在亲和层析中应用的价值就 越大。 2）具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与互补蛋白的亲和力没 有影响或影响不明显。 就目前所知，可用作配体的种类很多，表7-2。
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。 具体要求须根据分离物的性质而定： • 当分离物与配体亲和力弱时，选用多孔性好的基质可 提高结合容量； • 当分离物呈颗粒状或碎片状时，则选用多孔性差的基 质对改善分离效果有利。 一般亲和吸附剂采用的基质有：纤维素、聚丙烯酰胺 凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻 璃珠。
样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量， 与它们之间的亲和力有密切关系， 还与样品的pH值和离子强度有关系。
五、分离大分子物质（洗脱） 除去杂质 样品过柱后， 可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和力的杂蛋 白， 有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之； 最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。 洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲 和力决定：
四、特异性吸附 大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程
如图7-5所示
当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱(A)时， 欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；
当样品开始进入柱中时， 配体和欲分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，但也 有部分复合物分解； 当样品不断地通过柱子时， 欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。 也就是说，随着样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质的浓 度会恒定地增加(B)。 由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻碍，从而导致 产生紧密的复合物带(C)。
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
图7-4是植物血球凝集素(如Con· A)-Sepharose4B亲和 吸附剂的制备流程(供参考)。
3．配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体 的量表示的。如用mg／m1表示。 测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量 的参数。 具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
三、亲和吸附剂的制备 把配体偶联到基质上的方法有两类： 物理的（如包埋法和吸附法等） 化学的（如偶联法和交联法等）
交联法： 是用双功能试剂(如戊二醛、碳化二亚胺等)交联基质和配体。 偶联法： 常用的化学试剂有： 溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二 乙酸等， 用其活化的基质与配体偶联，或者用其把基质与配体螯合起来
•
•
(1)直接测定法 ①2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 ②根据配体的特性进行测定 (2)间接测定法
①推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止， 根据上样量即可推算出配体的结合量。
亲和层析法 根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的 层析方法，称为亲和层析法(affinity chromatography)。
亲和层析的原理(见图7-1)：
• 每对反应物之 间都有一定的 亲和力。 正如在酶与底物 的反应中，特 异的底物(S’)才 能和一定的酶 (E)结合，产生 复合物(E-S’)一 样。 • 在亲和层析中 是特异的配体 才能和一定的 生命大分子之 间具有亲和力， 并产生复合物。
六、亲和层析柱的再生 当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐 溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重 新平衡。 经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层 析。 一般亲和层析柱都可以反复使用多次。
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
溴化氰偶联法 主要包括： • 1.活化 • 2.偶联 • 3.除去未结合的配体 • 4.配体结合量的测定等步骤。
1．活化基质
• 在一定量的贮存基质Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加 入等量的蒸馏水和2mol／L Na2C03溶液(pHll~12)，混匀。 • 另将称量的固体CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。 • 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的预冷 水及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。
相比之下，实践中应用较多的基质是： 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-300)、 多孔性玻璃珠、 琼脂糖珠(Sepharose 4B)。 三种基质中，目前应用最多的是： Sepharose 4B
• Sepharose • 由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖；
• 它基本上能符合理想基质的五点要求； • 同时Sepharose极易用溴化氰活化，并易于引入不同的 基团； • 在温和的条件下，可以连接较多的配体，容易吸附大 分子物质，且吸附容量也较大； • 此外，Sepharose 4B的结构比Sepharose 6B疏松，机械 强度比Sepharose 2B好。
例如, 用对氨基苯-ß -D-硫代吡喃半乳糖苷作为配体纯化ß -半 乳糖苷酶时， 如果把配体直接连于Sepharose 4B上所产生的衍生物A， 则不能吸附ß-半乳糖苷酶。 当Sepharose上引入氨乙基乙酰胺或引入 3，3’- 二氨基二丙胺琥珀酰胺再接配体时，所产生 的衍生物B和C(图7-8 B、C)都能吸附ß-半乳糖苷酶。 从衍生物A、B、C来看，随着手臂的增长，吸附能力 也增加了。 但是，并非越长越好，若过长，则有可能发生“手臂” 折叠弯曲，从而导致吸附容量降低。
图7—8 纯化ß -半乳糖苷酶的吸附剂
2．吸附剂衍生物的制备 构成“手臂”最多的方法： • 首先，把适当长度的氨基化合物共价结合到用溴化氰 活 化 的 琼 脂 糖 上 ， 制 成 十 分 稳 定 的 衍 生 物 ( 即 AHSepharose和CH-Sepharose) （常用的氨基化合物是1， 6-己二胺和6-氨基己酸。） • 在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含 羟基或氨基的任何化合物结合成固相载体。 • 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
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第七章亲和层析
特定抗原
酶 受体、结合蛋白 脱氢酶、激酶、干扰素、聚合酶、限制酶等 凝聚因子、脂酶、某些蛋白酶、DNA聚合酶 等 糖蛋白
对应单克隆或多克隆抗体
对应底物、辅酶、抑制剂 对应信号分子、效应物 染料配体 肝素 凝集素、苯基硼酸盐
高
高 高 低 低 低
凝集素、糖苷酶
核酸
对应糖
核酸结合蛋白、互补链
高
高
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
用于制备亲和吸附剂的配体应满足亲和性、特异性要 求;当偶联到载体上时,不妨碍其与目标分子的结合;在 将配体固定化时，应保证其与载体形成稳定的共价键， 不至于从载体上脱落下来.
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
亲和层析中的合适配体
待纯化的生物分子 特定抗体 抗体/免疫球蛋白 配体 对应抗原 蛋白质A/蛋白质G 特异性 高 低
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第七章 亲和层析 第二节 亲和层析配体
二、亲和配体的类型 亲和配体主要分为专一性小分子配体、基团特异性小 分子配体、专一性大分子配体和基团特异性大分子配 体。 专一性小分子配体包括固醇类激素、维生素和特定酶 抑制剂等 . 基团特异性小分子配体的种类最多，包括许多酶的辅 助因子及其类似物，以及仿生染料、硼酸衍生物和许 多氨基酸、维生素等
将配体固定化到载体上后，需检测一下配体的浓度， 以判断偶联过程成功与否。测定偶联上的配体的浓度 有这样几种方法： 1）差示分析法：用加入的配体量减去洗脱液中游离 配体量，即可得出偶联上的配体量。
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
2）直接测定法：直接测定制备好的亲和吸附剂上配 体的浓度。可以根据配体的性质用分光光度法、蛋白 质测定方法或特定基团测定方法来测定。 3）放射分析法：对于具有放射活性的配体，可以很 灵敏地测出固相化配体的浓度。 4）水解法：当配体的测定不受大量的载体水解产物 干扰时，可以用此法测定亲和吸附剂上配体的浓度。 水解的方法可视配体、载体的偶联情况而定，可以采 用酸水解或酶水解。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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06.05.2021
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
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第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
07第七章 亲和层析
图7—8 纯化ß -半乳糖苷酶的吸附剂
2．吸附剂衍生物的制备 构成“手臂”最多的方法： • 首先，把适当长度的氨基化合物共价结合到用溴化氰 活 化 的 琼 脂 糖 上 ， 制 成 十 分 稳 定 的 衍 生 物 ( 即 AHSepharose和CH-Sepharose) （常用的氨基化合物是1， 6-己二胺和6-氨基己酸。） • 在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含 羟基或氨基的任何化合物结合成固相载体。 • 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理 在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当 长 度 的 “ 手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架， 或许可以 减少基质的立体位阻 效应， 增加配体的活动度 , 伸入溶液的深度, 从而提高吸附剂的操作 容量。
四、特异性吸附 大分子物质在亲和层析柱中的吸附过程
如图7-5所示
当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层析柱(A)时， 欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；
当样品开始进入柱中时， 配体和欲分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，但也 有部分复合物分解； 当样品不断地通过柱子时， 欲分离的大分子物质与配体之间形成的复合物浓度越来越大。 也就是说，随着样品不断地通过柱子，欲分离的大分子物质的浓 度会恒定地增加(B)。 由于配体的存在使欲分离大分子物质的移动受到阻碍，从而导致 产生紧密的复合物带(C)。
图7-4是植物血球凝集素(如Con· A)-Sepharose4B亲和 吸附剂的制备流程(供参考)。
3．配体结合量的测定 配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶束缚配体 的量表示的。如用mg／m1表示。 测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量 的参数。 具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
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第七章 亲和层析
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7.2.4 配体的选择
7.2.4.2 配体的类型 •通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，
•如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分 子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。
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• 疏水性连接臂会对样品产生非特异性吸附，若非必 要，应尽量避免接入连接臂，或选择可自动引入连 接臂的活化方法，或选择接好连接臂的商品化载体 。
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第七章 亲和层析
赵世光 生物化学工程系·生物技术教研室
第一节 概述
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第七章 亲和层析
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层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
第七章亲和层析技术概论
• 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
2020/11/18
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
第7章 亲和层析
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
第一节 基本原理
欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质 L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离 的络合物L—S，其中的L又能与活化的基质M 之间能可逆地结合与解离的原理发 展起来的层析法。
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、特殊性洗脱
亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法
六、亲和层析柱的再生
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
2、专一性洗脱
7 亲和层析
②根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开， 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计 算出配体的含量） 算出配体的含量）
四、特异性吸附
当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时， 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入， 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在， 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带， 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不 同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 亲合力 还与样品的pH值 离子强度和反应时间有关 外，还与样品的 值、离子强度和反应时间有关 例1 图7-6，Sepharose-έ氨基乙酰 色氨酸甲酯亲和层析研究发现 ， 氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现 氨基乙酰 条件下， ①在高pH条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高 条件下 吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大 ②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小 在高离子强度条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量小 亲和层析柱分离γ-球蛋白时 例2 用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应 比3h 亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应1h比 得率高