高效液相色谱实验
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化学与材料工程学院
环境监测分析实验报告
实验名称:高效液相色谱分析苯-甲苯混合物
专业班级:应化13
学号:150313135
姓名:朱建南
指导教师:翟春
实验地点:敬行楼A210
实验日期:2016年11月28日
高效液相色谱实验
一、实验目的
1.了解HPLC仪器的基本构造和工作原理,掌握HPLC的基本操作;
2.学习苯-甲苯混合物的定性分析方法;
3.评价色谱柱柱效;
4.了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点;
5.学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理
不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同,当两相做相对运动时,组分在两相之间反复进行多次分配,最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成:包括高压输液系统、进样系统、分离系统,检测系统等
1.色谱定性分析方法
a保留时间定性 b 峰高增量定性
2.色谱定量分析方法
a 归一化法,要求所有组分必须全部出峰。
b 标准曲线法(外标法)。简单、方便, 结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
三、仪器与试剂
LC-1602A型高效液相色谱仪、甲醇(色谱纯) 、苯、甲苯、苯-甲苯
四、高效液相色谱仪操作步骤
1. 流动相的预处理
甲醇溶液,用0.45μm 有机滤膜过滤,超声波清洗器脱气10~20 min,装入流动相贮液瓶。
2. 准备苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样
3. 高效液相色谱仪操作
a 依次高压输液泵和检测器电源开关;
b 打开色谱工作站,在仪器控制面板中,设置波长,并开灯;
c打开三通阀,在仪器控制面板中,设置流速为5ml/min, 启动高压泵,排除流路中的气泡。排气结束后,点击停止按钮,停止高压泵。
d 关闭三通阀,设置最小压力(0.1)和最大压力(20),并设置实验需要的流速
(0.5ml/min),启动高压泵。
e用平头微量注射器洗涤进样口后,取试液30 μL,将进样阀柄置于“Load”位置时
注入样品,转动阀柄至“Inject ”位置,此时软件自动进入“采集数据”模式。
注意!平头微量注射器用甲醇清洗3次后,再用试液清洗3次,避免气泡。
f 待所有色谱峰流出完毕后,按“停止采集”键,保存数据。
g 点击谱图处理中的定量结果,记录组分的保留时间以及峰面积、峰高等色谱信息。 注意!注射器进不同样品前,使用专用清洗注射器在进样阀的“Load ”和“Inject ”位置,用流动相清洗几次。
注意!注射器进不同样品前,使用专用清洗注射器在进样阀的“Load ”和“Inject ”位置,用流动相清洗几次。
4.结束工作
所有样品分析完毕后,流动相继续流动10~20 min ,至基线稳定。关闭检测器,按“Stop ”停泵。关闭泵电源。
五、 实验容
1. 分别进样苯、甲苯标样和苯-甲苯混合试样,保留时间定性,记录苯-甲苯混合试样色谱谱,计算分离度。
2. a. 分别采集系列甲苯溶液以及未知试样的色谱图,根据保留时间定性,确定甲苯组分峰的位置,并测定各自的峰面积。
b. 根据实验数据,利用外标法绘制标准工作曲线,并计算待测溶液中甲苯的含量。
六、实验图谱与数据处理
1、0.001%
图1:含量0.001%的液相色谱图
信号值(mAu )时间(min
)
2、0.01%
图2:含量0.01%的液相色谱图
3、0.1%
图3:含量0. 1%的液相色谱图
0123456
-20
24
6
8
10
12
14
信
号值
(mAu )时间(min )
3.948
3.798
3.415
2.391
0123456
-20
2040
60
80
100
120140信
号
值(mAu )
时间(min )
3.968
3.820
3.437
4、苯增0.1%
图4:苯增0.1%的液相色谱图
5、
1%
图5:含量0.001%的液相色谱图
0123456
50100
150
200250
300
信
号值
(mAU )
时间(min )
3.428
3.813
3.962
2.402
0123456
-200
200
400
600
800
1000
1200
14001600
1800信号
值(mAU )时间(min )
3.4383.800
3.967
苯
苯
峰
面
积
(
mAU*s
)
含量(%)
图6:含量与峰面积的标准曲线图
已知待测样中加入了0.1%的标样,其苯的峰面积为1436.477(AU*s),甲苯的峰面积为709.341(AU*s)。从图6中找出对应的苯含量为0.123(%),甲苯为0.0623(%)。七、思考题:
(1)若进样之后,没有样品峰出现,有哪些可能的原因?
答:仪器漏液;分析时间过短;进样量少、样品浓度低等
(2)与气相色谱柱相比,为何液相色谱柱一般都很短?
答:高效液相色谱柱采用的填料粒径很小,常规5-20um,填料还有涂层、键合物等,这样物质在经过色谱柱的时候分配的次数就相当多了。气相色谱柱的填料粒径较大,或是无填料,与液相色谱柱比较起来的话,气相的色谱柱单位长度的理论塔板数要远远低于液相,为了达到比较理想的分离效果,要求理论塔板数要达到一定的数量,因此气相的色谱柱一般都比高效液相的色谱柱长得多。
(3)为了提高液相色谱的分离效果,可采取哪些有效措施?