仪器分析实验-高效液相色谱法
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱测定物质浓度
仪器分析实验报告实验名称：高效液相色谱测定物质浓度一、实验内容1、学习高效液相色谱仪的使用2、利用高效液相色谱法测定溶液中物质的浓度二、实验步骤分别向液相仪注射苯、萘、甲苯、混合四种液体，测定谱图，并利用标准曲线，测定其浓度。
三、数据处理标准曲线：实验数据：0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-7.5-5.0-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.535.037.540.042.545.047.550.0mAU254nm,4nm (1.00)1.401/6571311.872/71922.076/440242.315/176632.542/32972.731/14743.338/3466684.311/107074.829/722055.436/3447766.381/5633图四 苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10-505101520253035404550556065mAU254nm,4nm (1.00)4.280/810108图五 甲苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10010020030040050060070080090010001100mAU254nm,4nm (1.00)1.281/2692011.523/1123671.851/198352.054/339512.313/57782.523/16233.361/56544.306/46304.591/2586585.394/16492918图六 萘0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-20-100102030405060708090100110120130140150160mAU254nm,4nm (1.00)1.363/7093351.890/487072.107/685472.299/240562.512/86352.741/134203.331/4865384.265/8520234.813/1162295.403/26525186.383/5382图七 混合数据计算：表一 混合液中各物质保留时间、峰面积及浓度计算物质苯 甲苯 萘 保留时间（min ） 3.331 4.265 5.403 峰面积（mAu ） 496538 852023 2652518 浓度（ug/ml ）339.854374.9208.803四、数据分析1.谱图中存在一定的杂峰，可能是由于溶液被污染2.保留时间存在一定的差异，可能是由于混合溶液中各组分之间会相互影响3.实验中要注意清洗针头，避免相互污染，并且要尽量排除气泡。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
仪器分析-色谱法
高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。
太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。
2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。
3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。
1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。
吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。
一般采用5~10μm的全多孔型微粒。
这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。
5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
4）应与所用检测器相匹配。
例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。
第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析实验的课后习题答案及讨论
高效液相色谱1．高效液相色谱法的特点特点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量准确度高，应用围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定有机及生化试样的高效别离分析方法。
2.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进展广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率〔柱效能〕；(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进展，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。
3.高效液相色谱的定性和定量分析的方法定性：〔1〕利用纯物质定性的方法利用保存值定性：通过比照试样中具有与纯物质一样保存值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。
不适用于不同仪器上获得的数据之间的比照。
利用参加法定性：将纯物质参加到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。
〔2〕利用文献保存值定性相对保存值r21：相对保存值r21仅与柱温和固定液性质有关。
在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保存数据，可以用来进展定性鉴定。
定量：有归一法、标法、外标法在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、标法或外标法等，但高效液相色谱在别离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而标法定量则被广泛使用。
4．高效液相色谱实验时，选择流动相时应注意的几个问题〔1〕尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
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➢ HPLC进样针与GC有何不同？ ➢ 为什么HPLC与GC进样要求不同？
五、 RP-HPLC测定烷基苯化合物原理
感谢聆听仪器分析实验-高效液相色源自法三、 HPLC仪器和实验技术
➢ HPLC仪器的基本组分？ ➢ 主要部件的工作原理？ ➢ HPLC和GC仪器的比较 ➢ HPLC和GC实验技术的比较 ➢ 有人认为色谱分析实验很简单，就是打一 针样品而已，你是怎么认为的？你是否给病 人打过针？为什么没有？
四、高效液相色谱仪的基本组成
二、色谱实验条件
A组：Waters HPLC仪
色谱柱：Nova Pak C18 (3.9×150mm, 4μm) 流动相：CH3OH-H2O (70/30, v/v) 流速：0.8 mL/min 检测波长：254nm 进样体积：20μL
B组：TSP HPLC仪
色谱柱：Hypersil BDS C18 (4.0×200mm, 5μm) 流动相：CH3OH-H2O (80/20, v/v) 流速：0.8 mL/min 检测波长：254nm 进样体积：20μL
➢ 什么是正相色谱？什么是反相色谱？ ➢ 什么是键合固定相？ ➢ 预测一下苯和甲苯在C18反相柱上的保留 顺序？ ➢ 什么是反相色谱疏水机理？ ➢ 本实验的主要色谱分析条件有那些？ ➢ 流动相组成对保留时间有何影响？举例说 明？ ➢ 改变检测波长对色谱图有何影响？
HPLC的溶剂选择
➢ 本实验采用什么流动相？ ➢ 什么是HPLC级甲醇、乙腈溶剂？ ➢ 如何获得超纯水？ ➢ 本实验所用的流动相如何配制？ ➢ 流动相为什么要除气？如何除气？
六、实验部分
一、溶液配制 1 配制标准系列溶液
三组分混标液：每mL溶液分别含1.00mg苯、甲苯 和乙苯。 分别准确移取0.40、0.80、1.20、1.60和2.00mL 三组分混标液于10mL容量瓶中，用流动相溶剂定容。
2 流动相的配制、过滤和除气。
五组分混标液：含适量苯、甲苯、乙苯、丙苯和丁苯。 标准苯测试液。 未知样品1号、2号和3号。