第三章高效液相色谱分析
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高效液相色谱分析
第三章 高效液相色谱分析基本要点：1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围；2. 了解高效液相色谱仪的主要部件及高效液相色谱法基本流程；3. 理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围；4. 理解各种分离方式的原理及选择原则。
第一节 高效液相色谱法的特点一、概述液相色谱法是指流动相为液体的技术。
早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。
这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。
70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。
成为一种高效、快速的分离技术。
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9×107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
二、特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于 1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
第三章 液相色谱法
2010/3/29
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
2010/3/29
液相色谱仪（1）
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液相色谱仪（2）
2010/3/29
液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
2010/3/29
一、高效液相色谱法的特点
2010/3/29
流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
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色谱方法选择
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Polarity (极性）
Non-polar
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
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液相色谱仪（1）
2010/3/29
液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
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一、高效液相色谱法的特点
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流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
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色谱方法选择
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Polarity (极性）
Non-polar
仪器分析第三章 高效液相色谱分析
2019/2/28
2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物， 而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高 分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 • 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。 • 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2.主要部件
(1) 高压输液系统（储液器、高压泵、过滤器） 高压泵
为了获得高柱效， HPLC 使用粒度很小的固定相（ <10 μm），液体 流经色谱柱受到的阻力大 应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。 分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。
2019/2/28
梯度洗提装置（P84）
2019/2/28
3. 流动相选择
在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。 例：采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分 的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 常用溶剂的极性顺序：水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙 醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己 烷>煤油(最小) 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性 或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
高效液相色谱法教程
由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗
全多孔型固定相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 二、流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选 择性。 （2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选 用检测器波长比溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
第二节 高效液相色谱仪
梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不 透明的，它严重干扰组分的吸收测量。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。 （3）高纯度 由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也 要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪 峰”。
固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
第三章高效液相色谱
GC与HPLC比较
GC
HPLC
流动相 惰性气体（无亲和性，只 不同极性的液体（有一
起运载作用）
定亲和作用）
气体、沸点较低的化合物 分析对象
高沸点、不稳定的天 然产物、生物大分子、 高分子化合物
温度
较高
一般室温
高效液相色谱法的类型
（一）分配色谱 （二）吸附色谱 （三）离子交换色谱法 （四）排阻色谱法
min.
前处理
过滤后，进样10μＬ
葡萄酒的色谱图
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3 . 酒石酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 焦谷氨酸
前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10μＬ
min.
酱油的色谱图
1. 磷酸 2. 柠酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸
氨基甲酸酯前处理过程
8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试 样同时分析的色谱图
公众比以前更加关注食品安全。
氨基甲酸酯类农药
灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲 丁威，残杀威，恶虫威，克百威 (呋喃丹),速灭 威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹
氨基甲酸酯类农药结构
丁醛肟威
呋喃丹
残杀威 （PHC， Arprocarb）
二甲杀威 （MPMC）
异丙威 （MIPC）
甲硫威 （Mercaptodim
分配色谱法
(Partition Chromatography)
分配色谱
液液分配色谱(LLPC)
液体固定相通过物理 吸附固定于载体表面
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
高效液相色谱法分析食品中的残留农药
高效液相色谱法分析食品中的残留农药第一章：引言在食品安全问题日益引起人们的关注的背景下，残留农药成为一个备受关注的话题。
近年来，残留农药对食品安全和人体健康造成了一定的威胁。
因此，分析食品中的残留农药的方法和技术变得至关重要。
本文将介绍一种常用的分析方法——高效液相色谱法（HPLC），并探讨其在食品中检测残留农药方面的应用。
第二章：高效液相色谱法概述2.1 高效液相色谱法原理高效液相色谱法是一种基于分离技术的分析方法，其原理是将待分析的混合物溶解在溶剂中，并通过高压将其进样到色谱柱中，然后使用流动相沿着色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。
高效液相色谱法具有分辨率高、灵敏度好、选择性强等特点，被广泛应用于各个领域，特别是食品检测领域。
2.2 高效液相色谱法的仪器设备高效液相色谱法依赖于多种仪器设备，包括进样器、色谱柱、流动相泵和检测器等。
其中，进样器用于将待分析样品引入色谱柱，色谱柱用于样品的分离，流动相泵用于提供流动相进行分离过程，检测器则用于定量分析分离后的化合物。
第三章：高效液相色谱法在食品中的应用3.1 高效液相色谱法分析食品中的残留农药的流程在分析食品中的残留农药时，首先需采集样品并根据需要进行前处理以去除可能的干扰物，然后将样品溶解于适当的溶剂中，通过进样器将样品引入色谱柱进行分离，最后通过检测器进行定量分析。
3.2 高效液相色谱法在不同食品中的应用高效液相色谱法广泛应用于各类食品中残留农药的分析。
例如，在蔬菜中，可以使用高效液相色谱法对杀菌剂、除草剂等农药进行分析。
在水果中，可以使用高效液相色谱法对杀虫剂、杀菌剂等农药进行分析。
此外，高效液相色谱法还可以应用于粮食、肉类等食品中残留农药的分析。
3.3 高效液相色谱法的优势和不足高效液相色谱法在食品中分析残留农药方面有许多优势。
其具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等优点。
然而，高效液相色谱法也存在一些不足之处，如需要专业的仪器设备和技术支持，分析周期长等。
09第三章液相色谱
出峰顺序相反。
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性；
按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。
常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、
乙腈、水
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极 性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
3. 流动相选择
非极性~中等极性组分（用于HPLC 80%）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
离子交换色谱 ion-exchange chromatography
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液 ；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组
4.7.2
离子色谱流程与装置类型
抑制型；非抑制型:
排阻色谱
size- exclusion chromatography
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。 小分子可以扩散到凝胶空隙， 由其中通过，出峰最慢；中等 分子只能通过部分凝胶空隙， 中速通过；而大分子被排斥在 外，出峰最快；溶剂分子小， 故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可 对 相 对 分 子 质 量 在 100-105 范围内的化合物按质量分离
兼顾柱效和分析时间， 选择u 1ml / min
2）涡流扩散项及其影响因素
A 2 dp
A dp
，dp A H ，n 柱效
第三章
高效液相色谱
(High Performance Liquid Chromatography )(HPLC)
液相色谱仪
高效液相色谱分析
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
五、 影响分离的因素 1. 影响分离的因素 （1） 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万 分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可以忽 略不计，即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所 示。
5. 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的 一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了 特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为 柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，
是测定混合阴离子的有效方法。
6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（反相柱）。
2. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使
用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
高压 高速
3 . 流程及主要部件 （1） 流程
（2）主要部件
① 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10m），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
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第三章 高效液相色谱法
§3.1 高效液相色谱概述
? 高效液相色谱 ? High Performance Liquid Chromatography，HPLC ? 或高压液相色谱 ? High Pressure Liquid Chromatography ? 或高速液相色谱 ? High Speed Liquid Chromatography ? 是在经典的柱层析、薄层层析和气相色谱的基础上发展
缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾
三、离子对色谱 ion-pair chromatograph
基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱
的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子 （对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成 疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之 间进行分配；
正相（极性柱）与反相（非极性柱）的练习
正相色谱-低极性流动相
反相色谱-高极性流动相
正相色谱-中极性流动相
反相色谱-中极性流动相
溶质极性A>B>C
二、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatograph
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸
固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是 5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
? 1、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography ? 2、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatography ? 3、离子对色谱 ion-pair chromatography ? 4、离子交换色谱 ion-exchange chromatography ? 5、离子色谱 ion chromatography ? 6、空间排阻色谱 steric exclusion chromatography
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。
反相高效液相色谱
硅 胶 Si（CH2）n CH3
? 常在硅胶或有机聚合物（如甲基丙烯酸酯类、苯乙烯－二 乙烯基苯）作为基质，其上键合C-18或C-8烷基的非极性固 定相→ C-18柱
? 以极性强的水、甲醇、乙腈为流动相
?药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量较小的蛋白质 ?→应用面广
正相高效液相色谱
氨基柱 氰基柱
? 固定相是具有一定极性的填料
? 流动相是不同极性的混合溶剂，常以己烷或环己烷做 基础溶剂
为洗脱极性较强的溶质，往基础溶剂中加入具有一定极 性的溶剂如二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃等
正相高效液相色谱主要用于分离易于水解的样品以及高 脂溶性样品（如甾醇类、磷脂类等，在水中几乎不溶）
流动相极性和pH值的选择也对分离起重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相
3．操作条件
可增大分离选择性
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大）
§3.2 影响液相色谱峰扩张及分离的因素
? 影响分离的因素与提高柱效的途径
? 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率 方程中的分子扩散项 B/u较小，可忽略不计，即：
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化
十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离
子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X- 进入流动相 后，生成疏水性离子对Y+ X -→在两相间分配。
柠檬酸根的离子对色谱分离
Question：柠檬酸3-用离子交换色谱分离？ 柠檬酸3-在酸性条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏 水性络合物→用C-18柱分离→碱性条件下络合物解离。
n↑)
仅做为一 种分离手 段
分离和分 析
2、HPLC与GC差别
?相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ?主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别
能气化、热稳定性好、且沸点较低样品
GC
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离
子型及高分子化合物的样品不可检测
1 分
仅能分析有机物的20%
析
溶解后能制成溶液的样品，不受样品
对
挥发性、热稳定性限制象HPLC源自分子量大、难气化、热稳定性差
及高分子和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
2 流
GC 惰性气体 组分与流动相无作用力，只与固定相作用
动
流动相种类较多，选择余地广
相 HPLC 液体
组分与流动相有相互作用力
为提高柱选择性、改善分离度增加 了可调控条件，对分离起很大作用
?
H=A+Cu
? 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
? 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低 传质阻力是提高柱效主要途径
?选低黏度流动相、适当降低柱温（降低黏度）但改善有限！
?改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
p69- 70 H-u曲线
§3.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
起来
1、 HPLC与经典LC区别
? 主要区别： 固定相差别，输液设备和检测手段
区别 固定相差别
输液设备 检测手段 用途
LC HPLC
柱内径 1~3cm，固 常压输送 分析周期
定相粒径 > 100μm 流动相 ； 长、无法
且不均匀
柱效低 (H↑, 在线检测
n↓)
柱内径 2~6mm，固 高压泵 输 分析时间 定相粒径 <10μm 送流动相； 缩短、可 （球形，匀浆装柱） 柱效高 (H↓, 在线检测
一、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography
固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相
的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反？（具体顺序） 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失→较少采用；
§3.1 高效液相色谱概述
? 高效液相色谱 ? High Performance Liquid Chromatography，HPLC ? 或高压液相色谱 ? High Pressure Liquid Chromatography ? 或高速液相色谱 ? High Speed Liquid Chromatography ? 是在经典的柱层析、薄层层析和气相色谱的基础上发展
缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾
三、离子对色谱 ion-pair chromatograph
基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱
的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子 （对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成 疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之 间进行分配；
正相（极性柱）与反相（非极性柱）的练习
正相色谱-低极性流动相
反相色谱-高极性流动相
正相色谱-中极性流动相
反相色谱-中极性流动相
溶质极性A>B>C
二、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatograph
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸
固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是 5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
? 1、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography ? 2、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatography ? 3、离子对色谱 ion-pair chromatography ? 4、离子交换色谱 ion-exchange chromatography ? 5、离子色谱 ion chromatography ? 6、空间排阻色谱 steric exclusion chromatography
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。
反相高效液相色谱
硅 胶 Si（CH2）n CH3
? 常在硅胶或有机聚合物（如甲基丙烯酸酯类、苯乙烯－二 乙烯基苯）作为基质，其上键合C-18或C-8烷基的非极性固 定相→ C-18柱
? 以极性强的水、甲醇、乙腈为流动相
?药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量较小的蛋白质 ?→应用面广
正相高效液相色谱
氨基柱 氰基柱
? 固定相是具有一定极性的填料
? 流动相是不同极性的混合溶剂，常以己烷或环己烷做 基础溶剂
为洗脱极性较强的溶质，往基础溶剂中加入具有一定极 性的溶剂如二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃等
正相高效液相色谱主要用于分离易于水解的样品以及高 脂溶性样品（如甾醇类、磷脂类等，在水中几乎不溶）
流动相极性和pH值的选择也对分离起重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相
3．操作条件
可增大分离选择性
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大）
§3.2 影响液相色谱峰扩张及分离的因素
? 影响分离的因素与提高柱效的途径
? 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率 方程中的分子扩散项 B/u较小，可忽略不计，即：
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化
十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离
子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X- 进入流动相 后，生成疏水性离子对Y+ X -→在两相间分配。
柠檬酸根的离子对色谱分离
Question：柠檬酸3-用离子交换色谱分离？ 柠檬酸3-在酸性条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏 水性络合物→用C-18柱分离→碱性条件下络合物解离。
n↑)
仅做为一 种分离手 段
分离和分 析
2、HPLC与GC差别
?相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ?主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别
能气化、热稳定性好、且沸点较低样品
GC
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离
子型及高分子化合物的样品不可检测
1 分
仅能分析有机物的20%
析
溶解后能制成溶液的样品，不受样品
对
挥发性、热稳定性限制象HPLC源自分子量大、难气化、热稳定性差
及高分子和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
2 流
GC 惰性气体 组分与流动相无作用力，只与固定相作用
动
流动相种类较多，选择余地广
相 HPLC 液体
组分与流动相有相互作用力
为提高柱选择性、改善分离度增加 了可调控条件，对分离起很大作用
?
H=A+Cu
? 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
? 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低 传质阻力是提高柱效主要途径
?选低黏度流动相、适当降低柱温（降低黏度）但改善有限！
?改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
p69- 70 H-u曲线
§3.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
起来
1、 HPLC与经典LC区别
? 主要区别： 固定相差别，输液设备和检测手段
区别 固定相差别
输液设备 检测手段 用途
LC HPLC
柱内径 1~3cm，固 常压输送 分析周期
定相粒径 > 100μm 流动相 ； 长、无法
且不均匀
柱效低 (H↑, 在线检测
n↓)
柱内径 2~6mm，固 高压泵 输 分析时间 定相粒径 <10μm 送流动相； 缩短、可 （球形，匀浆装柱） 柱效高 (H↓, 在线检测
一、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography
固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相
的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反？（具体顺序） 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失→较少采用；