细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光

1. 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。

2. 离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。

3. 离心、吸去固定液，用15 ml 4℃PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS 再次洗涤细胞。

4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5×106细胞。

5. 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。

6. 用4℃PBS稀释细胞和抗体至15 ml。

7. 离心，吸去PBS，以4℃PBS重悬细胞，重复1次。

8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5×106细胞用250 μl 抗体足够。

9. 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。

10. 除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。

11. 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。