细胞免疫荧光技术整理.整理.ppt
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
免疫荧光技术(医学相关)
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目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：
异硫氰酸荧光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其 主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
免疫荧光技术
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1
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技术原理
2
实验流程
3件
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免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在 细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激 发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。
漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。
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多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
免疫荧光技术
免疫荧光技术在肿瘤治疗中的应用：通过检测肿瘤细胞表面的抗原，帮助医生制定个性化的治疗方 案
免疫荧光技术在传染病治疗中的应用：通过检测病原体表面的抗原，帮助医生制定针对性的治疗方 案
免疫荧光技术的 优缺点
优点
灵敏度高：能够检测到低浓度 的抗原或抗体
行标记
荧光信号的检测和成像
荧光信号的产生：通过荧光染料标记抗体或抗原，与靶标结合后产生荧 光信号
荧光信号的检测：使用荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行检测和定量分析
荧光信号的成像：通过荧光显微镜或流式细胞仪等设备，对荧光信号进 行成像和分析，获得细胞或组织中靶标的分布和表达情况
荧光信号的定量分析：通过对荧光信号的检测和成像，对靶标进行定量 分析和评估，为科学研究和临床诊断提供依据。
蛋白质相互作用研究
免疫荧光技术 可以检测蛋白 质之间的相互
作用
免疫荧光技术 可以定量分析 蛋白质相互作 用的强度和动
力学
免疫荧光技术 可以研究蛋白 质相互作用的
机制和功能
免疫荧光技术 可以应用于药 物筛选和疾病
诊断
疾病诊断和治疗
免疫荧光技术在疾病诊断中的应用：通过检测细胞表面的抗原，帮助医生快速准确地诊断疾病
免疫荧光技术的 发展趋势和未来 展望
发展趋势
自动化：免பைடு நூலகம்荧光 技术将更加自动化， 提高检测效率和准 确性
多重检测：免疫荧 光技术将实现多重 检测，提高检测的 灵敏度和特异性
便携式：免疫荧光 技术将更加便携式 ，方便现场检测和 快速诊断
智能化：免疫荧光 技术将更加智能化 ，实现自动分析和 诊断
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的位置和表达水平的常用技术。
下面我将从步骤和经验总结两个方面来回答你的问题。
免疫荧光实验步骤：
1. 样本制备，首先，收集细胞或组织样本，然后进行固定和切片处理，以确保样本的完整性和稳定性。
2. 抗原修饰，样本经过透化处理后，使用适当的抗原修饰方法，如热处理或酶解，以增强抗体的结合效率。
3. 抗体孵育，将样本与特异性的一抗（一般为多克隆抗体）孵育，使其与目标蛋白结合。
4. 荧光二抗孵育，将荧光标记的二抗孵育，使其与一抗结合形成复合物。
5. 染色与显微镜观察，样本经过洗涤后，使用荧光显微镜观
察，检测目标蛋白在细胞或组织中的分布和表达水平。
免疫荧光实验经验总结：
1. 选择适当的抗体，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，可以通过文献综述或试验验证来确定抗体的适用性。
2. 优化实验条件，包括抗原修饰、抗体浓度、孵育时间等实验条件的优化，以确保信号强度和特异性。
3. 合理的阳性和阴性对照，使用已知表达目标蛋白的阳性对照和不表达目标蛋白的阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 注意样本处理，样本处理的温和和一致性对实验结果至关重要，避免因处理不当导致假阳性或假阴性结果。
5. 数据分析和图像获取，在实验结束后，对荧光图像进行合理的获取和分析，避免图像处理过度或不足，确保结果的客观和准确。
以上是免疫荧光实验的步骤和经验总结，希望能够对你有所帮助。
如果还有其他问题，欢迎继续提问。
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
医学免疫学检验-免疫荧光技术课件xx年xx月xx日CATALOGUE目录•免疫荧光技术概述•免疫荧光技术的基本原理和步骤•免疫荧光技术的临床应用•免疫荧光技术的质量控制和标准化•总结与展望01免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种将抗原-抗体反应与荧光标记相结合的免疫学技术，通过荧光显微镜观察样本中待测抗原的含量和分布。
定义免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，对待测样本中的抗原进行特异性识别和结合，形成抗原-抗体复合物，再通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光信号，从而确定抗原含量和分布。
原理免疫荧光技术的定义和原理1免疫荧光技术的应用范围23免疫荧光技术广泛应用于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等临床疾病的诊断和鉴别诊断。
临床诊断免疫荧光技术还可用于细胞生物学、分子生物学等基础研究中，研究细胞和分子的定位、表达、相互作用等。
基础研究免疫荧光技术可用于药物筛选和药物作用机制研究，通过观察药物与细胞或组织的作用，评估药物的疗效和安全性。
药物研发20世纪40年代免疫荧光技术由瑞典科学家Axelsson和英国科学家Coons首次建立。
20世纪60年代免疫荧光技术得到广泛应用和发展，逐渐成为医学、生物学等领域的重要技术手段。
21世纪初随着新技术如激光共聚焦显微镜、多光子显微镜等的应用，免疫荧光技术不断发展，提高了分辨率和灵敏度，拓展了应用范围。
免疫荧光技术的发展历程02免疫荧光技术的基本原理和步骤免疫荧光技术的核心原理是抗原-抗体反应，即利用特异性抗体与相应抗原的结合反应，实现目标抗原的检测和识别。
免疫荧光技术利用荧光标记物作为示踪剂，将荧光染料标记在特异性抗体上，形成荧光抗体，再与目标抗原结合，形成的抗原-抗体复合物在一定激发波长下能发射出荧光信号，从而实现抗原的定量和定位检测。
样品制备将待检测组织或细胞制备成单细胞悬液，固定在载玻片上，制成涂片或组织切片。
免疫荧光染色将制备好的样品进行预处理，加入荧光抗体标记的一抗，室温孵育一定时间；洗涤后加入荧光标记的二抗，再次室温孵育一定时间；洗涤后加入缓冲甘油等封片介质，封片。
免疫荧光技术和细胞骨架的染色与观察ppt
12. 荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察（或避光保存待观察）。
DAPI 标示细胞核的基本原理
7. 0.05% Triton X-100-PBS 漂洗5次，每次5 min;
8. 滴加荧光素标记的二抗（已经稀释，请老师帮忙添加）50 ul，同样覆盖修 剪过的小封口膜片覆盖，室温孵育60 min（避光黑暗条件下进行）;
9. 0.05% Triton X-100 PBS漂洗4次，每次5 min; 10. 50 ul DAPI（已经稀释，请老师帮忙添加）染色5 min ，PBS漂洗 2 min；
决，结果判定的客观性不足， 技术程序也还比较复杂。
抗原的概念
1. 抗原是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异 性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物即抗 体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结 合的物质，也称为免疫原。
2. 前一种性能称为免疫原性或抗原性，后一种性 能称为反应原性或免疫反应性。
抗体
DAPI与溴化乙锭（EB）类似：与DNA双螺 旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与 DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基 团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，可 用UV（紫外光）的激发波长356nm进行观 察。
细胞核内的染色质主要是 脱氧核糖核酸（DNA） DNA的双螺旋结构
实验目的与要求
1. 掌握免疫荧光技术的基本原理及其应用； 2. 掌握荧光显微镜的成像基本原理及其应用。
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又 称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微 镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光组化技术PPT课件
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
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三，细胞/组织的形态被破坏
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可能的原因
相应的措施
➢ 抗原修复方法过于剧烈
➢ 预实验摸索合适的修复条件
➢ 组织切片从玻片上脱落
➢ 增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
➢ 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 ➢ 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
➢ 组织形态难以分辨
细胞免疫荧光技术
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实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
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2
实验原理
➢ 原位检测 ➢ 抗原抗体特异反应 ➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
必要时用恒温摇床摇洗
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免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ术
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免疫细胞化学技术注意事项
➢ 选择合适的方法 ➢ 材料要留好 ➢ 选择抗体 ➢ 选择标记酶 ➢ 封闭液的选择 ➢ 设定对照实验
仪器：
荧光显微镜
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实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
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实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
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实验用品
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
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二，高背景
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可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
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思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
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A
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疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
封闭 室温30min
PBS 洗涤
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃510min
荧光显微镜 观察
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6
实验结果
三，观察
human HeLa cells
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实验中应注意的问题
➢ 细胞不要铺的过密:60-70%
➢ 防止细胞污染 ➢ 固定时间不要太长,一般10-30min ➢ TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 ➢ 选择合适的封闭液 ➢ 二抗孵育后,一定要洗干净
➢ 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
➢ 组织固定不充分,自发裂解
➢ 及时固定;增加固定时间;
提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
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四，染色不正确
可能的原因
➢ 固定方法对于抗原不合适 ➢ 抗原修复方法不合适 ➢ 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
➢ 尝试不同的固定剂或增加固定时间 ➢ 尝试改变抗原修复条件 ➢ 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换