细胞传代标准化步骤

合集下载

vero细胞传代方法

vero细胞传代方法

Vero细胞传代方法
一、传代前准备
1.用75%酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

2.正确摆放使用的器械,保证足够的空间,不仅便于操作,而且减少污染。

3.点燃酒精灯,注意火焰不能太小。

4.取出室温保存的培养液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

二、传代步骤:
1.从培养箱内取出细胞,注意取出细胞时不要碰到瓶盖,用酒精棉球擦拭显微
镜的台面,再在镜下观察细胞。

2.打开瓶口:将各个瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

3.倒掉培养瓶中的培养基。

4.加入500ul/小瓶(培养面积___cm2)的胰酶(4度中可存放几个月),并晃动
瓶子,使液体浸润瓶底。

5.将瓶置入孵箱约2-3分钟。

6.目测观察,见细胞层出现针状小孔,折光增加,弃去胰酶。

7.加入3ml的DMEM培养基稀释,注意更换吸管。

8.吹打15-20次左右,刚开始轻吹5次左右,然后用力吹,使细胞良好地分散
成单个细胞,镜下观察。

孵箱。

9.一传2,作好记号,置37℃,5%CO
2
10.一般2-3天长满。

注意事项:
1.操作过程中不能碰到瓶盖;
2.加培养液前移液管烧后先在培养基内回吸一次;
3.试验结束后用完的移液管要马上用水冲洗干净,再浸泡在洗衣粉溶液内;
4.胰酶消化不开细胞的,可能是胰酶失效或者细胞老化;
5.如果细胞长满不能及时传代就放在室温下第二天传,但是只能放一天;
6.生长液5%-10%血清,维持液2%-5%血清。

小瓶1传2小瓶
中瓶1传4小瓶(或2中瓶)。

细胞传代操作步骤及注意事项

细胞传代操作步骤及注意事项

细胞传代操作步骤及注意事项细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一,也是几乎所有细胞生物学实验的基础。

当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂,细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止,且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。

因此,细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释,分种成多瓶,细胞才能继续生长。

这一过程就叫传代。

细胞传代作为一种常规的实验操作,不但可以扩大细胞培养的数量,同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

所以为了让细胞保持在对数生长期,维持细胞旺盛的分裂能力,这时候就需要进行细胞传代。

细胞传代要在严格的无菌条件下进行,并且根据不同细胞采取不同的方法:☑贴壁生长的细胞用消化法传代;☑部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代;☑悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代,或直接用自然沉淀法吸除上清后,再吹打传代。

上次讲了细胞复苏操作,今天来讲讲细胞传代的操作(适用于贴壁细胞的传代培养)!细胞复苏流程图细胞传代流程图01细胞传代前准备➡实验开始前,将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台,紫外线照射30min。

➡将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。

➡倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度,当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。

02胰蛋白酶/EDTA消化➡弃去旧培养基,PBS洗去残留的旧培养基,重复洗两次。

注意:贴壁加入到培养皿的边缘,不能直接对着细胞加入PBS,容易把细胞都吹起来。

这一步的目的是为了去掉残余的培养基,残余的培养基会含有血清和一些离子等,不利于接下来的消化。

➡弃去PBS,加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA(T25培养瓶加入约1.5mL,T75培养瓶加入约3mL),迅速铺匀,保证充分接触细胞表面(消化时间视具体细胞而定)。

➡显微镜下观察消化情况,约70%~80%细胞收缩变圆后,轻拍培养容器外壁,使细胞脱离培养表面。

细胞传代标准操作流程

细胞传代标准操作流程

细胞传代标准操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改,请根据实际需要进行相应的调整和使用,谢谢!并且,本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料,如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等,如想了解不同资料格式和写法,敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!随着科学技术的不断发展,细胞传代技术在生物学研究和医学领域中扮演着至关重要的角色。

细胞传代标准操作规程

细胞传代标准操作规程

细胞传代标准操作规程细胞传代培养标准操作规程一、实验名称:细胞传代培养二、实验目的:传代培养细胞株三、背景知识:随着培养时间的延长和细胞不断分裂,一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制,生长速度减慢甚至停止;另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

此时就需要将培养物分割成小的部分,重新接种到另外的培养器皿(瓶)内,再进行培养。

这个过程就称为传代(passage)或者再培养(subculture)。

对单层培养而言,80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间,与细胞世代或倍增不同。

在一代中,细胞倍增3~6次。

细胞传代后,一般经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度,即细胞群的分裂相数/100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2%~0.5%,肿瘤细胞可达3~5%。

细胞接种2~3天分裂增殖旺盛,是活力最好时期,称指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。

四、实验原理:细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

五、实验材料和药品:(一)实验药品:DMEM培养基,小牛血清,0.25%胰蛋白酶,PBS缓冲液。

(二)实验仪器和材料:CO2培养箱,倒置显微镜,超净台;培养瓶,弯头吸管,废液缸,离心管;75%酒精棉球,酒精灯,培养细胞六、实验步骤:1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

将实验所需培养基置37℃下预热。

3.手在进入超净台前应消毒;超净台台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面30min左右,打开抽风机,关闭超净台的紫外灯,清洁空气,除去臭氧。

细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项

细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项

细胞传代的步骤(贴壁细胞为例)
首先,镜下观察细胞密度,90%以上即可传代培养(为了细胞的稳定,距离上 一次传代至少间隔一天。)。
准备工作:无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品,培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类,可根据情况,提前放入生物安全柜,进行紫外灭菌;
细胞传代的步骤(贴壁细胞为例)
培养液量 (ml)
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量(105) (约) 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量,需要考虑一下几点: 1. 常规实验的设计:转染siRNA(约30%-50%),转染质粒(约70%-
结合镜下观察,调整浓度。 ❖2. 计数细胞:参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量,再根据实验的
要求,计算加入的细胞的数量。(使用计数板)
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡!
数上不数下,数左不数右
计算公式: n/4 x104 (个/ml)
4.其他:轻轻移动他人的细胞,轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作:FBS,完全培养基,DMSO,或无血清冻存液,冻存管,冻存盒。 常规的细胞传代步骤,至细胞消化后离心完毕,根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液; 冻存液: 10%DMSO+90%FBS/完全培养基(A),或者无血清冻存液(B)。 冻存程序: A : 1. 使用冻存盒:可直接放入-80℃冰箱,第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中,吸去培养基,加入无菌PBS(只要没过即 可),轻轻摇动清洗细胞,尽量弃尽PBS。

细胞传代标准化步骤

细胞传代标准化步骤

细胞传代标准化流程:
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手;
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液;
2、将培养基(如有需要还有血清和大瓶高糖培养基)、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒;
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取(大培养皿6ml,中
培养皿3ml)至一个新的15ml离心管中;(一个1ml枪头)
5、用适量PBS清洗细胞表面(大皿5ml,中皿3ml),并弃去PBS;(一个5ml枪头)
6、加入适量胰酶消化细胞(大皿1ml,中皿0.5ml),此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化;(C2C12用5min,3T3-L1用1.5min),(一个1ml枪头)
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入离
心管;(一个5ml枪头)
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基;
9、弃上清,口擦酒精,烧口;
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右),按合适比例进行细胞传代,
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。

(一个1ml枪头)
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常;
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。

细胞培养传代详细方法步骤经验总结

细胞培养传代详细方法步骤经验总结

传代
镜下观察细胞生长融合达70-80%,准备传代。

常规开紫外照射超净台20分钟,同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。

25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。

20分钟后开始传代。

1先弃掉旧培养液,加PBS洗一次,
2然后加0。

25%胰酶2ml消化(指25乘25cm大小的培养瓶)细胞,镜下观察细胞,细胞突起回缩,细胞变圆,然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右(当然时间是随机的,比如:新配的胰酶作用时间短一些,配制时间长的胰酶作用时间会长一些,当然要不断地镜下观察),待细胞大部分消化下来(大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁),
3加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。

反复吹打瓶壁上残留的细胞,并将已消化下来的细胞吹打均匀,然后吸入离心管中1000转离心1分钟,然后弃掉上清,用手指将离心管中的细胞弹打均匀,
4加新培养基,吹打均匀,
5分至3个新的培养瓶中,补足培养液。

将培养瓶平放,小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。

6次日观察。

beas-2b细胞传代步骤

beas-2b细胞传代步骤

beas-2b细胞传代步骤Beas-2B细胞是一种人类正常气道上皮细胞系,广泛应用于气道疾病的研究中。

要进行Beas-2B细胞的传代,需要经过以下步骤。

步骤一:准备工作在进行细胞传代之前,需要准备一些实验室常用的培养基和试剂,如DMEM/F12培养基、胎牛血清、三春霉素等。

步骤二:细胞解冻从液氮罐中取出存放Beas-2B细胞的冻存管,将其迅速放入37℃的水浴中解冻。

解冻后,将细胞转移到离心管中,并通过离心将细胞沉积在管底。

步骤三:细胞培养将培养基预先加热至37℃,并添加适量的胎牛血清。

将解冻后的细胞转移到含有培养基的离心管中,并用移液器轻轻混合。

将混合后的细胞转移到细胞培养瓶中,放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

步骤四:观察细胞增殖培养的前几天,观察细胞的生长情况。

正常情况下,Beas-2B细胞会开始进行增殖,细胞数量逐渐增多,培养瓶内的细胞会呈现出充实的状态。

步骤五:细胞分离当细胞生长到80%至90%的密度时,即细胞达到对数生长期,可以进行细胞分离。

首先,将培养瓶中的培养基倒掉,并用PBS缓冲液冲洗细胞两次,以去除残留的培养基。

然后,加入适量的胰酶-EDTA 消化液,使细胞与其充分接触,并放入37℃的培养箱中进行消化。

随后,用细胞培养液停止消化反应,并用移液器轻轻吹洗,使细胞从底部离析。

步骤六:细胞传代将分离得到的细胞转移到新的细胞培养瓶中,加入适量的培养基,并放入培养箱中继续培养。

细胞传代后,可以观察到细胞数量的进一步增加,培养瓶内的细胞再次呈现出充实的状态。

细胞传代的关键是控制好细胞的分离程度和传代次数。

过度分离会导致细胞死亡,而过多的传代次数则可能引起细胞老化。

因此,在进行细胞分离和传代时,需要根据实际情况来进行调整,以保证细胞的生长和稳定。

总结起来,Beas-2B细胞的传代步骤包括准备工作、细胞解冻、细胞培养、观察细胞增殖、细胞分离和细胞传代。

通过合理的控制和操作,可以成功地进行Beas-2B细胞的传代,并为后续的实验研究提供可靠的细胞资源。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

细胞传代标准化步骤 Last revised by LE LE in 2021
细胞传代标准化流程:
穿戴好白大褂和手套,用75%酒精擦手;
1、取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代或换液;
2、将培养基(如有需要还有血清和大瓶高糖培养基)、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后,将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;
3、点燃酒精灯,将瓶口拧松,过火消毒;
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,将培养皿中的培养基取(大培养皿6ml,
中培养皿3ml)至一个新的15ml离心管中;(一个1ml枪头)
5、用适量PBS清洗细胞表面(大皿5ml,中皿3ml),并弃去PBS;(一个5ml枪头)
6、加入适量胰酶消化细胞(大皿1ml,中皿0.5ml),此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内
消化;(C2C12用5min,3T3-L1用1.5min),(一个1ml枪头)
7、待消化完全后,用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化,并吹打培养皿皿底,将细胞移入
离心管;(一个5ml枪头)
8、1000rpm,5min离心,离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿,并加好培养基;
9、弃上清,口擦酒精,烧口;
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右),按合适比例进行细胞传
代,在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。

(一个1ml枪头)
11、将所有试管收至冰箱,将废液缸及废液取出,装至一次性PE手套,废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面,检查显微镜、离心机是否关闭,孵箱是否正常;
13、做试验记录,打开超净台和细胞间紫外,15min后关闭。

相关文档
最新文档