细胞传代培养标准操作规程
实验五细胞传代培养6
实验5 细胞传代培养【实验原理】细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
【实验目的】熟练掌握细胞的传代培养方法。
【器仪、材料及试剂】1．仪器：倒置显微镜，培养箱、超净工作台等。
2．材料：贴壁细胞株、培养瓶、吸管、废液缸等。
3．试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）。
【操作步骤】1．将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2．加入0.5—1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3．瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶弃去，加入10ml培养液终止消化（观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1—3分钟）。
4．用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
附：消化液配制方法：称取0.25克胰蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
胰蛋白酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。
【注意事项】1．传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉污染。
2．酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。
3．传代后每天观察细胞生长情况，了解细胞是否健康生长：健康细胞的形态饱满，折光性好。
4．掌握好代传代时机：健康生长的细胞生长致密，即将铺满瓶底时，即可传代【实验报告】试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤。
【思考题】1．细胞传代培养的目的是什么？2．判断细胞健康的标准是什么？3．如何估计是否传代和传代的方式？。
细胞传代操作步骤及注意事项
细胞传代操作步骤及注意事项细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。
因此，细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
细胞传代作为一种常规的实验操作，不但可以扩大细胞培养的数量，同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。
所以为了让细胞保持在对数生长期，维持细胞旺盛的分裂能力，这时候就需要进行细胞传代。
细胞传代要在严格的无菌条件下进行，并且根据不同细胞采取不同的方法：☑贴壁生长的细胞用消化法传代；☑部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代；☑悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打传代。
上次讲了细胞复苏操作，今天来讲讲细胞传代的操作（适用于贴壁细胞的传代培养）！细胞复苏流程图细胞传代流程图01细胞传代前准备➡实验开始前，将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台，紫外线照射30min。
➡将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。
➡倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。
02胰蛋白酶/EDTA消化➡弃去旧培养基，PBS洗去残留的旧培养基，重复洗两次。
注意：贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。
这一步的目的是为了去掉残余的培养基，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。
➡弃去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面（消化时间视具体细胞而定）。
➡显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。
细胞传代标准操作流程
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细胞传代标准操作规程
细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞倍增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。
（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将实验所需培养基置37℃下预热。
3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞培养传代标准操作规程
1、目的：建立Vero细胞培养传代标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养传代的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养传代操作流程。
2、范围：适用于Vero细胞培养传代实验人员.3、编制依据《企业注册标准WS4—（S—009-2）—2003Z》。
4、Vero细胞培养传代操作规程4。
1试药与试液1、细胞：Vero细胞。
2、液体：0。
25%胰蛋白酶溶液；7。
5%碳酸氢钠溶液;小牛血清；PBS缓冲液；10×199培养液、灭菌注射用水、EDTA溶液。
4.2仪器与用具1、恒温培养箱；2、倒置生物显微镜。
4。
3操作方法4.3.1细胞培养、传代1、准备好细胞培养传代所需物品，紫外线照台30min。
2、挑选细胞形态佳、无污染的Vero细胞，弃旧生长液.3、细胞面经少量EDTA溶液洗涤后,加入胰蛋白酶等消化液适量（胰酶铺平培养瓶底为佳），倒置显微镜下观察培养瓶内细胞,一旦发现大量细胞胞质回缩,细胞间隙增大，但未脱离培养瓶底，立刻用吸细胞液的滴管吸出胰酶弃去，4、把细胞培养瓶置37。
0℃±0。
5℃孵育让残存的胰酶继续消化,（在37℃胰酶消化效果最佳）,每1min把培养瓶拿到倒置显微镜下观察，当观察到细胞变圆,透亮，细胞间隙明显增大时，加入先配好的完全培养基适量终止消化,用吸管轻柔吹打分散细胞，制备成均一的细胞悬液。
5、取一滴细胞悬液进行计数（此步骤是为了积累培养细胞的经验,观察多少密度的细胞具体几天可以长满,待有经验后此步骤可以省略.）6、传代：不同细胞根据细胞数量、生长快慢、难易等,一般按照1：3-1：5比例进行传代。
先用滴管吹打混匀细胞悬液，平均分配细胞悬液到各个培养瓶中，补足完全培养基使液体总体积达到40ml左右，平放到培养箱中继续培养。
7、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。
4。
3.2填写记录：1、随试验进程做好试验记录（按实验记录规范要求)，包括试剂的厂家、批号、效期，试验时间，试验结果。
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创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*
细胞传代培养（消化法）标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
1. 传代前准备
（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
（5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
（8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
3. 吹打分散细胞
（1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
（4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
（1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。
最后要做好标记。
（2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
5. 悬浮型细胞的传代
（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
注意事项：
1.严格的无菌操作。
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。
10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。
注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*。