微卫星不稳定性的检测和意义
微卫星不稳定性检测在结直肠外科的应用及其临床意义
微卫星不稳定性检测在结直肠外科的应用及其临床意义
蒋松松;陈刚
【期刊名称】《中国肿瘤外科杂志》
【年(卷),期】2022(14)5
【摘要】结直肠癌中约15%患者存在基因组微卫星高度不稳定(MSI-H),最新的美国国立综合癌症网络与中国临床肿瘤学会指南均推荐所有结直肠癌患者都要进行微卫星不稳定(MSI)检测以判断预后,并可以用于林奇综合征的诊断与筛查;早发性结直肠癌患者的MSI-H频率更高,且好发于近端结肠(右半结肠),所以临床上对于年轻的结直肠癌患者,尤其是右半结肠癌患者,更应该重视MSI的检测。
MSI-H的结直肠癌患者预后更好,免疫治疗对于MSI-H的结直肠癌疗效显著,目前国内外指南均建议MSI-H的结直肠癌全线推荐免疫治疗,但是MSI-H的误诊可能导致免疫一线治疗患者疾病进展,所以结直肠外科医师需要积极探索新的错配修复基因通路蛋白、微卫星不稳定性的检测位点及新的检测方式,以提高诊断准确率。
【总页数】6页(P498-503)
【作者】蒋松松;陈刚
【作者单位】南京大学医学院附属鼓楼医院结直肠外科
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.结直肠癌微卫星不稳定性的临床意义
2.结直肠癌中微卫星不稳定性与PD-L1表达的关系及临床意义
3.应用荧光标记PCR对散发性结直肠癌进行微卫星不稳定性检测
4.PD-L1、CD8在Ⅱ/Ⅲ期微卫星高度不稳定性结直肠癌中的表达及临床意义
5.结直肠癌微卫星不稳定性与程序性死亡配体1表达的临床意义
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MSI诊断检测的方法和应用
标记荧光类型 HEX FAM FAM HEX TMR TMR FAM HEX TMR
MSI 检 测 送 样 要 求
▪ 若客户提供石蜡切片，则要求厚度5-20μm的石蜡切片（切片 中确保含有9mm2以上大小的组织块）10片或以上，注明石蜡 包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。 ▪若客户提供DNA样品，则从新鲜组织提取的DNA最佳， 20ng/μl以上的DNA 20μl即可（需提供DNA浓度）；若为石蜡 包埋组织提取的DNA，除了提供DNA的浓度（20ng/μl以上的 DNA至少20μl）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图
重现 性
时间
成本
操作
IHC
~90% 低
低 3-5天 500~1000 复杂
直接测序 法
80~100%
高
高 5-7天 1000~2000 简便
多重荧光 PCR
100%
高
高 2-3天 500~1000
简便
Microread MSI 检 测 试 剂 盒
▪ 阅微基因根据NCCN指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了MSI检 测的试剂盒。
MSI 检 测 案 例
13MS6C
13MS6E
* 接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织13MS6C和正常组织13MS6E，要求检测该肿瘤组 织的MSI状态，6个单核苷酸位点均未出现MSI，鉴定结果为MSS稳定状态。
阅微基因诊断试剂简介
脆性X综合征检测试剂盒 五种特性检测脆性X综合征：准确计算CGG重复数、灵敏度高于
另一类为散发性结直肠癌,这一类肿瘤发生MSI概率约15 ％ ～30％；
大肠癌微卫星不稳定性及其临床意义
大肠癌微卫星不稳定性及其临床意义关键词：结直肠肿瘤；微卫星DNA；微卫星不稳定性【摘要】目的了解大肠癌微卫星不稳定性（microsatellite instability, MI）情况。
方法用6个微卫星位点检测PCR扩增所选位点PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染。
结果60例大肠癌中，20例表现MI，其中11例为复制错误（replication errors, RER）阳性。
RER阳性与RER阴性大肠癌患者相比，发病年龄较年轻，一级亲属有恶性肿瘤病史者明显高于RER阴性，倾向位于结肠，呈浸润性生长，Ⅲ～Ⅳ期比例高。
5例大肠癌伴大肠腺瘤病例中，4例腺瘤有MI。
结论中国人大肠癌MI发生率介于文献报道之间，MI为大肠癌形成过程中的早期分子事件，RER为肿瘤易感指标之一。
微卫星DNA 是大量随机分布于真核生物整个基因组中的1～6个简单重复核苷酸序列，微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)是指由于复制错误(replication errors, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失，其在恶性肿瘤发生发展过程中的作用已受重视，被认为是大肠癌的一种发病机制。
我们对60例大肠癌组织的MI进行了研究，并结合临床病理资料，探讨其临床意义。
材料与方法1.标本收集和基因组DNA提取：自浙江医科大学第二附属医院肿瘤科1996年3月～1997年5月间经病理证实的大肠癌患者60例，男37例，女23例。
年龄32～78岁，平均年龄(56±12)岁。
按Dukes分期标准，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期27例。
现场取手术切除组织标本，立即置入液氮中保存，直至提取基因组DNA。
每份标本包括肿瘤组织和相应的正常肠粘膜，基因组DNA提取采用蛋白酶k消化，酚氯仿抽提法。
2.MI检测：选用了D2S119、D13S160、D8S282、D3S1293、D2S123和D18S58等6个微卫星位点进行检测，PCR反应体系为50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-Cl, 0.1%Trito X-100, 1.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTPS,模板DNA200 ng，上下游引物各50 pmol，Taq酶1U，加去离子水至50 μl。
肿瘤微卫星不稳定性(MSI)
结果分析
结果判读
MSI 分型
标准
MSI-H（高频不稳定） 2个及以上位点出现新峰
MSI-L（低频不稳定） 1个位点出现新峰
MSS （相对稳定） 准单态性单核苷酸微卫星基因座未出现新峰
结果分析
结果分析
结果分析
案例分析
• 病理分期：II期、pT3N0M0 • 术后病理诊断：升结肠溃疡性高分化腺癌，部分为粘液腺癌，肿瘤大小
吉非替尼 (n=132)
1.0
卡铂紫杉醇 (n=129)
吉非替尼 (n=91)
1.0
卡铂紫杉醇 (n=85)
0.8
HR (95% CI) = 0.48 (0.36, 0.64) HR (95% pC<I)0.=0000.418 (0.36, 0.64) 0.8
HR (95% CI) = 2.85 (2.05, 3.98) p<0.0001
0.6
吉非替尼事件p<数0.,009071(73.5%)
卡铂吉紫非杉替醇尼事事件件数数, ,19171 ((7836..50%%))
0.6
吉非替尼事件数, 88 (96.7%) 卡铂紫杉醇事件数, 70 (82.4%)
卡铂紫杉醇事件数, 111 (86.0%)
0.4
0.4
无进展生存概率 无进展生存概率
肿瘤微卫星不稳定性（MSI）检测 ——荧光PCR-毛细管电泳法
➢ MSI与结直肠癌 ➢ MSI检测对CRC的意义 ➢ MSI在其他癌症中的应用 ➢ MSI的检测方法及产品介绍 ➢ 数据汇总 ➢ 结果分析
➢ 附录检测报告模板
MSI与结直肠癌（CRC）
结直肠癌发病率
Colon & rectum cancers
肿瘤微卫星不稳定性（MSI）检测
肿瘤微卫星不稳定性（MSI）检测每年可以指导约 5.8 万 MSI-H 的中国肿瘤患者进行免疫药物治疗。
微卫星不稳定性（Microsatellite Instability, MSI）微卫星 (Microsatellite) 是遍布于人类基因组中的短串联重复序列, 有单核苷酸、双核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10-50 次。
与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做微卫星不稳定性。
大量研究表明，MSI 是由错配修复 (MMR) 基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。
临床上已将MSI 作为结直肠癌及其他实体瘤预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物，并应用于协助 Lynch 综合征筛查。
对于不同肿瘤，其存在dMMR/MSI-H 的比率是不同的，具体比例如下图所示：检测意义据文献报道，大约 15% 的结直肠癌中存在 MSI-H 现象，与 MSS 特征的结直肠癌相比，其发病机制、预后和对药物的敏感性均不同。
在非结直肠癌的实体瘤中，也存在着不同比例的 MSI-H 现象，MSI 状态不同的实体瘤在对 Keytruda 响应率方面存在显著性差异。
1. 转移性结直肠癌（mCRC）患者对 PD-1 免疫治疗获益预测2015 年在新英格兰医学杂志发表的 NCT01876511 研究结果表明，PD-1 单抗治疗对 MSI-H 的 mCRC 表现出高缓解率，因此 Keytruda 单抗治疗 MSI-H 的 mCRC 获得 FDA 突破性疗法认定。
右图即是 FDA 批准 Keytruda 治疗 MSI-H 的 mCRC 的临床证据。
图中黑线、红线分别代表 MSI-H 和 MSS 的患者，无论是从无进展生存期还是总体生存率来看，同样是接受 Keytruda 治疗的情况下，具有 MSI-H 特征的比具有 MSS(微卫星稳定性) 特征的 mCRC 患者生存期更长。
2. MSI-H 的实体瘤（非结直肠癌）抗 PD-1 免疫治疗获益预测2017 年，FDA 批准 Keytuda 用于治疗 MSI-H 或 dMMR 的实体瘤患者。
微卫星不稳定检测及其结果判定
微卫星不稳定检测及其结果判定人类错配修复(MMR)基因除了检验和校正复制期间发生在微卫星样重复DNA序列上小的插入和丢失之外，还防止解旋的DNA序列重新结合。
MMR基因突变破坏了MMR蛋白的功能，引起重复DNA序列的产生及DNA修复错误，从而导致患者DNA出现微卫星不稳定(MSI)。
Lynch综合征是一种由错配修复(MMR)基因种系突变引起的常染色体显性遗传病。
MSI检测具有重要临床意义：1、诊断Lynch综合征：MSI是Lynch综合征的重要生物学标记，当MSI-H被证实，该诊断即可成立;2、判断预后及治疗效果：MSI-H的结直肠癌患者对化疗药物5-氟尿嘧啶的疗效不佳;3、鉴别遗传性胚系来源与散发性来源的MSI结直肠癌：散发性MSI-H结直肠癌的病因通常是hMLH1基因启动子甲基化，只有小部分为BRAF基因突变致MMR基因沉默而免疫组化阴性，并出现MSI。
若肿瘤MMR基因启动子甲基化或BRAF基因突变阳性，说明为散发性癌;4、筛查：Bethesda修订指南建议对小于50岁的患者常规进行MSI检测。
根据Bethesda修订指南，有下列指征的患者需做MSI检测：1、患者年龄小于50岁;2、肿瘤位于右半结肠;3、易发生肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;4、术后易再发其他原发性恶性肿瘤;5、肿瘤有淋巴细胞浸润;6、多分泌黏蛋白或有印戒细胞;7、浸润性生长模式。
MSI检测目前有以下两种检测方法：1、PCR技术检测方法对石蜡切片进行人工显微切割提取DNA，以一些微卫星点为标记指导合成引物进行PCR，通过凝胶电泳分析得出MSI谱，进行比较分析。
最常用的2个Promega分析系统由5个单核苷酸标记点(BAT-25、-26，MONO-27，NR-21、-24)构成;而美国国家癌症研究所(NCI)参考系统由3个双核苷酸(D2S123、D5S346和D17S250)和2个单核苷酸(BAT-25和-26)构成。
当胚系谱中微卫星的长度改变，MSI的诊断即可成立。
MSI微卫星不稳定性
MSI微卫星不稳定性的临床试验进展
总结词
MSI微卫星不稳定性的临床试验进展主要集中在MSI检测方法的优化、MSI与肿瘤预后 的关系以及基于MSI的个性化治疗策略。
详细描述
目前，MSI的检测主要采用PCR和下一代测序技术。为了提高MSI检测的准确性和灵敏度，研究者们正在不 断优化检测方法。同时，越来越多的临床试验开始关注MSI与肿瘤预后之间的关系，以期为患者提供更精准
目前MSI的检测主要基于PCR和免疫组织化学方法，未来可能会有更高效、灵敏和特异的检测方法，如基于质谱技术 和纳米技术的检测方法。
MSI与其他疾病的相关性研究
MSI与多种癌症的发生和发展密切相关，未来将进一步研究MSI与其他疾病（如神经退行性疾病、自身免 疫性疾病等）的关系，为相关疾病的预防和治疗提供更多线索。
MSI与肿瘤的发生、发展、转移和预 后等生物学行为密切相关，可以作为 肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后判 断的重要参考指标。
MSI微卫星不稳定性的治疗策略
对于MSI阳性的肿瘤患者，由于其基因组不稳定，对某些化疗药物和放疗较为敏感，因此治疗时应选 择适当的药物和方案，以提高疗效和降低副作用。
靶向治疗是MSI阳性肿瘤的另一种治疗策略，针对MSI相关的基因突变或信号通路进行干预，可有效 控制肿瘤进展。
MSI可以分为MSI-H（高不稳定）、MSI-L（低不稳定） 和MSS（微卫星稳定）三种类型，其程度不同，与肿 瘤的发生和发展密切相关。
MSI微卫星不稳定性与肿瘤的关系
01
MSI与多种肿瘤的发生和发展密切相关，特别是结直肠癌、子宫内膜 癌、胃癌和胰腺癌等。
02
MSI肿瘤通常具有一些独特的生物学特征，如基因组不稳定、突变负 荷高、免疫原性等，这些特征有助于肿瘤的进展和转移。
msi评分医学
MSI评分医学1. 简介MSI（Microsatellite Instability，微卫星不稳定性）是一种遗传学特征，常见于一些肿瘤类型，如结直肠癌、胃癌和子宫内膜癌等。
MSI评分医学是通过对肿瘤组织中微卫星不稳定性的检测和评估，来帮助医生判断肿瘤的风险等级、预后以及治疗方案选择等。
2. MSI评分的意义2.1 预后判断MSI评分可以帮助医生判断患者的预后情况。
一般来说，高MSI分数与较好的预后相关联，因为高MSI分数通常意味着免疫系统对肿瘤细胞的较强杀伤作用。
而低MSI分数则与较差的预后相关联。
2.2 治疗方案选择根据患者的MSI评分结果，医生可以更好地选择适合患者的治疗方案。
例如，在结直肠癌中，高MSI分数患者可能会从免疫治疗中获益更多；而低MSI分数患者则可能更适合传统的化疗方案。
2.3 家族遗传性肿瘤综合征筛查高MSI分数也可以提示存在家族遗传性肿瘤综合征的可能性。
例如，Lynch综合征就与高MSI分数相关。
通过MSI评分，可以帮助医生筛查出潜在的家族遗传性肿瘤综合征患者，进一步进行相关的遗传咨询和检测。
3. MSI评分方法目前，常用的MSI评分方法主要有两种：PCR法和免疫组化法。
3.1 PCR法PCR法是一种通过扩增微卫星位点来检测微卫星不稳定性的方法。
该方法需要设计一组特定的引物来扩增肿瘤组织中的微卫星位点，并通过电泳等技术来检测扩增产物的大小变异。
根据不同微卫星位点扩增产物大小变异程度，可以计算出MSI评分。
3.2 免疫组化法免疫组化法是一种直接检测肿瘤组织中mismatch repair（MMR）蛋白表达情况的方法。
MMR蛋白是维持微卫星稳定性的关键蛋白，其表达异常与微卫星不稳定性相关。
通过检测MMR蛋白的表达情况，可以间接评估MSI状态。
4. MSI评分结果解读根据MSI评分结果，可以将肿瘤分为三个等级：高度微卫星不稳定（MSI-H）、低度微卫星不稳定（MSI-L）和微卫星稳定（MSS）。
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微卫星不稳定性的检测
和意义
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微卫星不稳定性的检测和意义
秦皇岛第四医院病理科康文喜岳秀杰杨崔航
1981年Miesfeld从人类基因文库中发现一段长约2-10个核苷酸片段，他将这一小段核苷酸片段命名为“微卫星”(microsatellite,MS)。
人体在正常状态下，微卫星的长度和排序保持不变，并且稳定遗传。
但在某些因素作用下，微卫星的DNA在复制过程中由于滑动等因素，导致双链分子的碱基发生错配、插入或缺失，引起微卫星的结构发生改变，这种结构上发生改变的微卫星就叫做微卫星不稳定性
(microsatelliteinstability,MSI)。
近年来的研究表明，微卫星不稳定性尤其是高度微卫星不稳定性与许多肿瘤的发生和发展关系密切。
研究认为微卫星不稳定性在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，是肿瘤形成又一机制。
在正常人体细胞内，微卫星的分子结构保持稳定不变，其原因是在人体细胞内有一种能够修复微卫星的安全保障体系，这种安全保障体系是由一系列特异性修复微卫星碱基错配的酶分子组成，叫做微卫星错配修复系统(mismatchrepairsystem,MMR)。
人体细胞中由于错配修复系统系统的存在，才能避免遗传物质发生改变，保证DNA复制的高保真度。
微卫星突变后会使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化，最终发生恶性肿瘤。
进一步的研究表明，很多肿瘤的发生如肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺癌……等均与微卫星不稳定性密切相关。
在对多种癌组织进行微卫星不稳定性检测后发现，其微卫星不稳定性的突变率明显增高。
在遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）中微卫星不稳定性的突变率可高达70-90%，散发性大肠癌微卫星不稳定性的突变率也高达28.85%。
因此，微卫星不稳定性的检测已经成为筛选恶性肿瘤的重要诊断指标。
目前临床上微卫星不稳定性的检测主要利用免疫组化或多聚酶链反应方法，检测项目有MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。
微卫星不稳定性检测的意义：
1、判断预后：目前大量证据表明，错配修复基因缺失/高度微卫星不稳定性是Ⅰ期结直肠癌患者预后良好的一个标志物。
2、指导治疗：一项回顾性研究结果显示，高度微卫星不稳定患者并不能从5-FU的辅助化疗中获益。
如果考虑氟尿嘧啶类单药治疗，推荐行MMR检测。
3、帮助筛选Lynch综合征：Lynch综合征，既往亦称遗传性非息肉性结肠癌，是一种常染色体显性遗传病。
由于MMR基因发生胚系突变所致，约占所有结直肠癌的3-5%。
总之，高度微卫星不稳定性检测对于结直肠癌患者的预后判断和治疗指导具有重要意义。