微卫星不稳定性
肿瘤微卫星不稳定性（MSI）检测
肿瘤微卫星不稳定性（MSI）检测每年可以指导约 5.8 万 MSI-H 的中国肿瘤患者进行免疫药物治疗。
微卫星不稳定性（Microsatellite Instability, MSI）微卫星 (Microsatellite) 是遍布于人类基因组中的短串联重复序列, 有单核苷酸、双核苷酸或高位核苷酸的重复，重复次数10-50 次。
与正常细胞相比，肿瘤细胞内的微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，就叫做微卫星不稳定性。
大量研究表明，MSI 是由错配修复 (MMR) 基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。
临床上已将MSI 作为结直肠癌及其他实体瘤预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物，并应用于协助 Lynch 综合征筛查。
对于不同肿瘤，其存在dMMR/MSI-H 的比率是不同的，具体比例如下图所示：检测意义据文献报道，大约 15% 的结直肠癌中存在 MSI-H 现象，与 MSS 特征的结直肠癌相比，其发病机制、预后和对药物的敏感性均不同。
在非结直肠癌的实体瘤中，也存在着不同比例的 MSI-H 现象，MSI 状态不同的实体瘤在对 Keytruda 响应率方面存在显著性差异。
1. 转移性结直肠癌（mCRC）患者对 PD-1 免疫治疗获益预测2015 年在新英格兰医学杂志发表的 NCT01876511 研究结果表明，PD-1 单抗治疗对 MSI-H 的 mCRC 表现出高缓解率，因此 Keytruda 单抗治疗 MSI-H 的 mCRC 获得 FDA 突破性疗法认定。
右图即是 FDA 批准 Keytruda 治疗 MSI-H 的 mCRC 的临床证据。
图中黑线、红线分别代表 MSI-H 和 MSS 的患者，无论是从无进展生存期还是总体生存率来看，同样是接受 Keytruda 治疗的情况下，具有 MSI-H 特征的比具有 MSS(微卫星稳定性) 特征的 mCRC 患者生存期更长。
2. MSI-H 的实体瘤（非结直肠癌）抗 PD-1 免疫治疗获益预测2017 年，FDA 批准 Keytuda 用于治疗 MSI-H 或 dMMR 的实体瘤患者。
深度解析：关于MSI（微卫星不稳定性）
深度解析：关于MSI（微卫星不稳定性）图1 MSI在肿瘤细胞中序列长度发⽣改变根据造成结直肠癌MSI分⼦机制的不同可分为两类：）：常由MLH1启动⼦区域⾼DNA甲基化造成MMR功1. 偶发性MSI结直肠癌（sporadicCRC）：能缺陷引起MSI。
偶发性MSI结直肠癌约占所有结肠癌患者的12%，易发⽣在⽆明显家族遗传史的⽼龄化个体中，MMR缺陷直接发⽣在结直肠癌体细胞中；）：⼜称Lynch综合症，占所有结直肠癌患者的2%-2. 遗传⾮息⾁病性结直肠癌（HNPCC）：5%，家族遗传性疾病，由于⽣殖细胞中携带有MMR基因突变，因⽽MMR功能易缺陷导致MSI结直肠癌出现。
常见Lynch综合症患者中MMR基因突变位点易发⽣在四个相关基因中：MLH1，MSH2，MSH6，PMS2。
根据结直肠癌中MSI被检测出的频率可以将其分为三类（图2）：MSS，⽆明显的MSI出现；MSI-L，MSI出现频率低，⼀般低于30%；MSI-H，MSI出现频率低，⼀般⾼于30%。
图2 美国NCI机构制定的MSI检测分类标准⼀、MSI常⽤检测⽅法：MSI常由MMR基因突变及功能缺失导致。
因此，在检测癌细胞中MSI时，既可以直接检测MSI序列变化，也可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发⽣MSI。
两种检测⼀致性很好，MSI检测发现的结直肠癌中近93%也适⽤于MMR基因缺陷检测。
不同的是技术⼿段，MMR基因缺陷检测常依赖于免疫组化（蛋⽩⽔平），⽽MSI检测⼀般依赖于分⼦⼿段，PCR检测(DNA⽔平)（图3）。
图3 MMR免疫组化检测与MSI分⼦检测结果免疫组化检测的优势是可以直接鉴定出导致MSI发⽣的MMR缺陷基因，但是，约5%-11%的MSI发⽣并不会出现MMR蛋⽩的缺陷。
某些MMR蛋⽩错义突变，会损失MMR功能，但能被抗体检测识别，因此这是分⼦检测的优势，⽬前常⽤的检测MSI的⽅法是分⼦检测结合免疫组化检测。
⼆、MSI检测——NCCN指南解读1、MSI检测应在所有结直肠癌史的病⼈中进⾏针对结直肠癌患者的MSI检测准确度⾼图4 MSI分⼦检测结直肠癌常⽤marker⽬前，近15%的偶发结直肠癌及Lynch综合症结直肠癌患者含有MSI特征，通过MSI分⼦检测可以精准的检测结直肠癌中的MSI，尤以对MSI-H患者的检测，近100%准确度。
最新微卫星不稳定与结直肠癌课件PPT
实收资本
【 例 】 某 公 司 收 到 国 家 投 资 1200000 元 ， 法 人 投 资 500000 元，个人投资300 000元，共计人民币2000000 元，收到的款项全部存入该公司的开户银行。其会计分 录如下：
实收资本
•为了核算实收资本的增减情况，一般企业 应设置“实收资本”账户。
注册资本、实收资本与投入资本的关系
•
投入资本
初始投资
注册资本（实收资本、股本） 资本公积（资本、股本溢价）
追加投资
注册资本 （实收资本、股本） 资本公积 （资本、股本溢价）
实收资本
（一）企业接受投资者以现金投入的资本 企业接受投资者以先进投入的资本，应当
所有者权益表明企业的产权关系，即 企业归谁所有。所有者权益和负债都有属 企业的权益。
所有者权益的组成内容
• 按现行会计制度的规定，所有者权益一般由以下几部分组 成：
(1)实收资本。指投资者按照企业章程或合同、 协议的约定，实际投入企业的各种财产、物资的价 值。按投资主体，可分为国家投资、法人投资、外 商投资和个人投资。
（4）在企业清算时，债权人有优先求偿权，而 投资人则必须在偿还所有债务之后，有剩余才给 投资人分配。因而，所有者权益是一个与负债性 质不同的会计要素。
实收资本
实收资本
•实收资本：投资者投入企业各种 资产的价值。 •所 有 者 按 照 企 业 章 程 或 者 合 同 、 协议的约定，实际投入企业的资 本。 •我国实行的是注册资本制度，要 求企业的实收资本与其注册资本
MSI微卫星不稳定性
MSI微卫星不稳定性的临床试验进展
总结词
MSI微卫星不稳定性的临床试验进展主要集中在MSI检测方法的优化、MSI与肿瘤预后 的关系以及基于MSI的个性化治疗策略。
详细描述
目前，MSI的检测主要采用PCR和下一代测序技术。为了提高MSI检测的准确性和灵敏度，研究者们正在不 断优化检测方法。同时，越来越多的临床试验开始关注MSI与肿瘤预后之间的关系，以期为患者提供更精准
目前MSI的检测主要基于PCR和免疫组织化学方法，未来可能会有更高效、灵敏和特异的检测方法，如基于质谱技术 和纳米技术的检测方法。
MSI与其他疾病的相关性研究
MSI与多种癌症的发生和发展密切相关，未来将进一步研究MSI与其他疾病（如神经退行性疾病、自身免 疫性疾病等）的关系，为相关疾病的预防和治疗提供更多线索。
MSI与肿瘤的发生、发展、转移和预 后等生物学行为密切相关，可以作为 肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后判 断的重要参考指标。
MSI微卫星不稳定性的治疗策略
对于MSI阳性的肿瘤患者，由于其基因组不稳定，对某些化疗药物和放疗较为敏感，因此治疗时应选 择适当的药物和方案，以提高疗效和降低副作用。
靶向治疗是MSI阳性肿瘤的另一种治疗策略，针对MSI相关的基因突变或信号通路进行干预，可有效 控制肿瘤进展。
MSI可以分为MSI-H（高不稳定）、MSI-L（低不稳定） 和MSS（微卫星稳定）三种类型，其程度不同，与肿 瘤的发生和发展密切相关。
MSI微卫星不稳定性与肿瘤的关系
01
MSI与多种肿瘤的发生和发展密切相关，特别是结直肠癌、子宫内膜 癌、胃癌和胰腺癌等。
02
MSI肿瘤通常具有一些独特的生物学特征，如基因组不稳定、突变负 荷高、免疫原性等，这些特征有助于肿瘤的进展和转移。
微卫星不稳定性
遗传物质的突变是导致人类许多疾病(包括肿 瘤)的主要原因,而引起遗传物质突变的直接诱
因是不同类型的DNA损伤。其中多种原因造成 的DNA双链分子的碱基错配是导致突变的主要 DNA损伤类型之一。大量研究表明,从细菌、 酵母到人体细胞都存在一种能修复DNA碱基错 配的安全保障体系,这种保障体系是由一系列 特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,被称 为DNA错配修复系统(DNA mismatch repair system,MMR)。人体细胞中由于MMR系统的存 在,可保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗 传物质突变的产生,保证DNA复制的高保真度。
存在的问题：通过对人体多种肿瘤MSI的检测,目前已初步对体细胞 中MMR系统的功能以及MMR缺陷与肿瘤发生的相应关系有所认识,但 此仅仅是深入研究的开始而已,因为(1)人类MMR基因不仅具有识别和 修复DNA复制过程中出现的DNA错配的功能,有实验报道,该组基因还 以某种方式参与细胞对增殖的调控,其确切机理及调节方式有待进一 步研究。(2)大肠杆菌MutHLS系统中的MMR基因仅占大肠杆菌基因 组中突变控制位点(murator loci)的一半。除MMR基因外,其余占半数 的突变控制位点的基因组成了大肠杆菌细胞中的对突变产生具有明 显抑制作用的体系。由于细菌与人体细胞在MMR系统上表现出极大 的相似性,因而推测人体细胞除MMR系统外,也应含有类似于大肠杆 菌的其它突变抑制系统,该突变抑制系统也应该在维持人基因组稳定 性上发挥重要作用,其功能失活也参与了肿瘤的形成。目前,对人体细 胞中可能存在的此系统还不了解。(3)已有研究发现在hMSH2基因启 动子区域含有一个p53蛋白质的识别位点,据此推论, hMSH2基因可能 是受p53基因调控的一种靶基因,其正常功能在某种程度上依赖于p53 基因的调节。因而某些肿瘤组织中MMR缺陷并非由于MMR基因突变 所致,可能与MMR基因的调节基因变异有关。
微卫星不稳定性的检测和意义
微卫星不稳定性的检测和意义秦皇岛第四医院病理科康文喜岳秀杰杨崔航1981年Miesfeld从人类基因文库中发现一段长约2-10个核苷酸片段，他将这一小段核苷酸片段命名为“微卫星”(microsatellite,MS)。
人体在正常状态下，微卫星的长度和排序保持不变，并且稳定遗传。
但在某些因素作用下，微卫星的 DNA在复制过程中由于滑动等因素，导致双链分子的碱基发生错配、插入或缺失，引起微卫星的结构发生改变，这种结构上发生改变的微卫星就叫做微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)。
近年来的研究表明，微卫星不稳定性尤其是高度微卫星不稳定性与许多肿瘤的发生和发展关系密切。
研究认为微卫星不稳定性在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，是肿瘤形成又一机制。
在正常人体细胞内，微卫星的分子结构保持稳定不变，其原因是在人体细胞内有一种能够修复微卫星的安全保障体系，这种安全保障体系是由一系列特异性修复微卫星碱基错配的酶分子组成，叫做微卫星错配修复系统(mismatch repair system,MMR)。
人体细胞中由于错配修复系统系统的存在，才能避免遗传物质发生改变，保证DNA复制的高保真度。
微卫星突变后会使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化，最终发生恶性肿瘤。
进一步的研究表明，很多肿瘤的发生如肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、甲状腺癌……等均与微卫星不稳定性密切相关。
在对多种癌组织进行微卫星不稳定性检测后发现，其微卫星不稳定性的突变率明显增高。
在遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）中微卫星不稳定性的突变率可高达70-90%，散发性大肠癌微卫星不稳定性的突变率也高达28.85%。
因此，微卫星不稳定性的检测已经成为筛选恶性肿瘤的重要诊断指标。
目前临床上微卫星不稳定性的检测主要利用免疫组化或多聚酶链反应方法，检测项目有MLH1、MSH2、MSH6和PMS2。
微卫星不稳定性检测的意义：1、判断预后：目前大量证据表明，错配修复基因缺失/高度微卫星不稳定性是Ⅰ期结直肠癌患者预后良好的一个标志物。
MSI微卫星不稳定性
Bethesda vs. Amsterdam
预测MSI的标准 敏感度 特异度 27 94 46 90 90 60
Amsterdam
AmsterdamⅡ Bethesda
图2：建议的直肠癌患者在临床和分子水平确诊的策略
直肠癌患者
AmsterdamⅡ标准
临 床 标 准
Bethesda方针
分 子 水 平 分 析
，应除外MSI-H 群体。
MSI与预后的相关性
Gryfe et al. 2000年 多中心， <50岁 32个 研究 meta 3个中心 n=607 MSI-H 17% OS HR=0.42 P<0.01 不能从辅助5Fu中获益 5-Fu不获益
Popat S Benatti
2005年 2005年 2009年 ASCO
% Disease Free
DFS in pMMR patients
Stage II (N=428)
100 90 80 70 60 50 40 30 5 yr DFS 20 Untreated 72% HR: 0.84 (0.57-1.24) 10 Treated 77% p=0.38 0 0 1 2 3 4 5 Years
PCR检测
Bethesda标准，包括5个定位：2个单核苷酸（BAT 25,BAT26),3个双核苷酸（D5S346，D2S123，D17S250）
后来延伸至10个（BAT40，myb,TGFβRII, IGF2R,BAX) 最敏感的BAT40，BAT26，BAT25，myb （100.94.94.88%）
Merok
2012年
MSI与5-FU化疗的相关性
研究 784852 INT 0035 874651 GIVIO FFCD
结直肠癌微卫星不稳定性作用的进展
结直肠癌微卫星不稳定性作用的进展微卫星不稳定性：定义MMR对校正DNA复制过程中发生的错误配对非常重要，该修复系统主要包括4个蛋白，MLH、MSH2、MSH6和PMS2。
微卫星是包含1-6个碱基的重复DNA序列，分布于整个基因组，微卫星对复制错误易感，正常时可由MMR系统修复，缺失一个MMR蛋白功能时导致MMR系统缺陷，致微卫星复制错误累积，造成遗传不稳定性。
MSI发生在关键细胞功能与途径的编码区时具有致癌潜能，可以通过PCR扩增特异的微卫星标志或是免疫组化检测MMR蛋白缺失来发现MSI。
LS时MSI通常与一个MMR基因胚系突变有关（多为MLH1或MSH2），而散发MSI CRCs 通常是由hMLH1启动子甲基化表观失活所致。
林奇综合征LS是最常见的遗传性CRC，是高度不完全外显性常染色体疾病，特征是早期发作的结直肠癌和子宫内膜癌，某些结肠外癌症发生风险增加，包括其它部位的胃肠道肿瘤、泌尿道系统肿瘤以及女性生殖系统肿瘤，女性发生CRC风险52.2%，男性68.7%，中位诊断年龄61.2岁。
Amsterdam和Bethesda标准用于鉴别可能为L S的患者以进一步行遗传学检查，如表1和2所示。
现在许多指南建议采用二种方法排除LS：一种普遍适用，每个CRC患者均进行检测，另一种是＜70岁诊断CRC患者进行检测以及≥70岁、但满足Bethesda标准患者进行检测，超过1/4的LS患者漏诊（图1）。
表1 修订后Bethesda关于LS相关CRC 指南表2 Amsterdam II标准图1 林奇综合征诊断流程免疫组化与遗传学检查结果的吻合性很好，新专家共识推荐使用一组5个单核苷酸重复序列（BAT-25、BAT-26、NR21、NR24和NR27），其特征是不同个体间的单核苷酸重复序列数量和大小恒定。
根据MSI多少，CRCs分成高度微卫星不稳定性（MSI-H）、低度微卫星不稳定性（MSI-L）。
MSI-H 表型是5个标志中至少有2个不稳定标志，而多数散发CRCs 为微卫星稳定性（MSS），缺少MSI特征。
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存在的问题：通过对人体多种肿瘤MSI的检测,目前已初步对体细胞 中MMR系统的功能以及MMR缺陷与肿瘤发生的相应关系有所认识,但 此仅仅是深入研究的开始而已,因为(1)人类MMR基因不仅具有识别和 修复DNA复制过程中出现的DNA错配的功能,有实验报道,该组基因还 以某种方式参与细胞对增殖的调控,其确切机理及调节方式有待进一 步研究。(2)大肠杆菌MutHLS系统中的MMR基因仅占大肠杆菌基因 组中突变控制位点(murator loci)的一半。除MMR基因外,其余占半数 的突变控制位点的基因组成了大肠杆菌细胞中的对突变产生具有明 显抑制作用的体系。由于细菌与人体细胞在MMR系统上表现出极大 的相似性,因而推测人体细胞除MMR系统外,也应含有类似于大肠杆 菌的其它突变抑制系统,该突变抑制系统也应该在维持人基因组稳定 性上发挥重要作用,其功能失活也参与了肿瘤的形成。目前,对人体细 胞中可能存在的此系统还不了解。(3)已有研究发现在hMSH2基因启 动子区域含有一个p53蛋白质的识别位点,据此推论, hMSH2基因可能 是受p53基因调控的一种靶基因,其正常功能在某种程度上依赖于p53 基因的调节。因而某些肿瘤组织中MMR缺陷并非由于MMR基因突变 所致,可能与MMR基因的调节基因变异有关。
目前已发现RER+肿瘤主要有3类：一类为散发性结
直肠癌,这一类肿瘤细胞核型为近二倍体,病人预后 较好；另一类为HNPCC病人发生的结直肠癌、子 宫内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为 MSI,与散发性结直肠癌比较,发病年龄较早；第三 类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤, 这一类肿瘤MSI发生频率相对较低。近年来研究证 实RER+是HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱 癌的早期分子标志,也是慢性髓细胞性白血病的晚 期分子标志,对肾母细胞瘤来说,不仅是晚期分子标 志并与其恶性程度有关,对胃癌来说,不仅是其早期 事件,而且与癌的恶性转移有一定联系。并发现 MSI存在于病理证实为阴性的肿瘤旁切缘组织。
遗传物质的突变是导致人类许多疾病(包括肿 瘤)的主要原因,而引起遗传物质突变的直接诱
因是不同类型的DNA损伤。其中多种原因造成 的DNA双链分子的碱基错配是导致突变的主要 DNA损伤类型之一。大量研究表明,从细菌、 酵母到人体细胞都存在一种能修复DNA碱基错 配的安全保障体系,这种保障体系是由一系列 特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,被称 为DNA错配修复系统(DNA mismatch repair system,MMR)。人体细胞中由于MMR系统的存 在,可保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗 传物质突变的产生,保证DNA复制的高保真度。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
目前已经知道,RER+大肠癌有以下特性；(1)发病年龄早,35岁以
下大肠癌患者RER阳性比例最高；(2)多位于右半结肠,易发生 肠内或肠外其它器官的多发性肿瘤,多发性肿瘤RER阳性率 (80%)明显高于单发性肿瘤(11%),术后易再发其它原发恶性肿 瘤；(3)DNA多为二倍体或近二倍体；(4)对某些化疗药物(如顺 铂)有原发耐药性；(5)具有高突变特性,许多癌基因及抑癌基因 (如RAS,p53,APC等)突变数目明显增多；(6)粘液腺癌多见,组织 分化差,多浸润生长,肿块较大,但较少发生淋巴结转移,预后较 好,而RER-的大肠癌多发生在左半结肠,多为多倍体。晚期胃癌、 远端胃癌多为RER+,RER+表型在肠型和实体瘤中的频率显著高 于印戒细胞癌；近端胃癌早期多为RER-。这说明与RER+癌发 病机制不同。因此,检测不同肿瘤的MSI,对深入认识肿瘤病的 基因变化是十分有帮助的。目前,需大力开展对人体多种肿瘤 MSI的检测,了解各种肿瘤与MMR基因突变的关系,弄清肿瘤中 MMR基因的突变类型及作用方式,建立更为简便的基因突变的 检查技术并应用了临床。
微卫星不稳定性的研究方法，目前主要以PCR技
术为基础研究微卫星不稳定性改变，步骤为：(1) 首先需确定特定染色体上特定微卫星位点标记， 并根据其序列合成特异性引物。引物序列一般可 根据特定位点直接从基因库中查询。（2）收集肿 瘤组织及相应正常组织标本，酚、氯仿抽提，乙 醇沉淀，提取基因组DNA。（3）PCR扩增。（4） 扩增产物的检测。常用凝胶电泳，溴化乙锭染色 后在紫外灯下观察，或放射自显影及银染等方法 观察。（5）判断结果。若肿瘤组织较正常对照组 织出现某一基因条带消失或密度减少50％以上， 可判断为杂和性丢失；若肿瘤组织出现基因条带 的增多，即判断为不稳定性改变。
微卫星不稳定性
09 生物科学 二组
微卫星(microsatellite,MS),是指DNA基因组中小
于10个核苷酸的简单重复序列, 又称短串联重 复(short tandem repeat, STR)，是一种遍布于 人类基因组的重复序列，一般为2～6个碱基重 复，如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等，尤以(CA)n重 复序列最为常见。其长度由重复单位的拷贝数 决定，是一类呈高度多态的遗传标记，不仅可 用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位 与克隆，而且可用于遗传性疾病的连锁分析和 基因诊断。
在以后的研究中，相继在肺癌，胃癌，白血病 等其它肿瘤也发现微卫星不稳定性。Li等报道
一组100例包括头颈部肿瘤，膀胱肿瘤及肺癌 病例，用9个微卫星位点标记物筛选，发现3个 及4个核苷酸重复序列更易出现插入或缺失， 26例出现至少一个位点的改变。显示微卫星不 稳定性改变可作为肿瘤细胞的克隆标志，运用 于肿瘤的检测。肿瘤常在抑癌基因位点出现染 色体基因缺失，表现为等位基因杂合性丢失 (Loss of heterozygosity),通过检测分析肿瘤杂合 性丢失及其规律，可在染色体一定范围内发现 肿瘤的抑癌基因及易感基因。
微卫星不稳定性(microsatellite
instability,MSI)是指由于复制错误 (replication error, RER)引起的简单重复序列 的增加或丢失,也称RER阳性或RER表型。
1993年，Altonen等首次发现，在HNPCC细
胞中存在高频率的MSI后，又有很多学者在 多种肿瘤中发现MSI。MSI作为肿瘤遗传不 稳定一个敏感的检测指标已逐渐被大家接 受。