核酸分离纯化及鉴定
核酸提取与纯化试剂配方
核酸提取与纯化试剂配方核酸提取和纯化是分子生物学研究中常用的重要步骤。
核酸提取与纯化试剂包括溶解、提取、纯化和测定等步骤。
下面将详细介绍核酸提取与纯化试剂的配方和使用方法。
1. 细胞裂解缓冲液的配方：- 25mM Tris-HCl pH 8.0- 50mM EDTA- 1% SDS- 100μg/ml RNase A将以上试剂按比例混合制备成细胞裂解缓冲液，用于裂解细胞并保护核酸的完整性。
2. 提取缓冲液的配方：- 0.1M Tris-HCl pH 8.0- 0.14M NaCl- 0.001M EDTA- 1% SDS将以上试剂按比例混合制备成提取缓冲液，用于将细胞裂解液中的核酸与蛋白质分离。
3. 过滤缓冲液的配方：- 5M ammonium acetate- 100% isopropanol将5M乙酸铵与等量的100%异丙醇混合制备成过滤缓冲液，用于将核酸从提取液中沉淀。
4. 洗涤缓冲液的配方：- 70% ethanol将绝对乙醇与等量的去离子水混合制备成洗涤缓冲液，用于洗涤核酸沉淀，去除残留的盐类和蛋白质。
5. 纯化缓冲液的配方：- 10mM Tris-HCl pH 8.0- 1mM EDTA将以上试剂按比例混合制备成纯化缓冲液，用于重溶核酸并去除污染物。
使用步骤如下：1. 将待提取的细胞悬浮在细胞裂解缓冲液中，彻底裂解细胞膜。
2. 加入RNase A，在室温下孵育30分钟，酶解RNA。
3. 加入等体积的提取缓冲液，混合均匀后离心，将上清液转移至新离心管，保留上清液，其中含有DNA。
4. 加入等体积的过滤缓冲液，混合均匀后离心，将上清液抽取并丢弃，沉淀中包含核酸。
5. 加入洗涤缓冲液，混合均匀后离心，将上清液抽取并丢弃，重复一次洗涤步骤，确保去除残留的盐类和蛋白质。
6. 倒掉洗涤缓冲液，将离心管倒置在吸水纸上，待离心管底部的液滴完全干燥，避免残留的洗涤缓冲液影响纯化后的核酸。
7. 加入适量的纯化缓冲液，将沉淀重溶，确保核酸的完整性。
《核酸的分离纯化》课件
《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。
2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。
3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。
4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。
第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。
2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。
核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。
核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。
第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。
常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。
2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。
核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。
核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。
核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。
核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。
核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。
第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。
核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。
2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。
酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。
3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。
洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。
4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。
亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。
5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。
琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。
核酸分离纯化-经典版
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——RNA的保存
➢RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70℃保存 ➢长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ➢在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
➢ 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
（五）核酸的鉴定与保存
2. 核酸的保存——DNA的保存
➢DNA样品溶于pH8.0的TE缓冲液中，4℃或-20℃保存， -70℃冰箱可保存数年。
➢TE的pH为8.0时，DNA的脱氨反应减少，pH低7.0时 DNA易变性
➢分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。
（三）核酸的分离纯化
应该清除的杂质主要包括: 1.非核酸的大分子污染物
蛋白质、多糖及脂类物质等大分子物质 2.非目的的核酸分子
分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质 3.加入的有机溶剂和某些金属离子
核酸分离纯化的基本方法
1.加入浓盐溶液（如NaCl）
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
4.RNA酶（RNAase)抑制剂 （3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-Ribonucleoside
Complex, VRC)
一、核酸分离、纯化原则
(二)尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度 纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂 或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的 污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如 提DNA分子时，应去除RNA分子。
实验十三 动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间 的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶 核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成 ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物 质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在 40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
DNA标准曲线的制作和样品测定
管 试 剂 0 对照 DNA标准溶液,ml 0.0 蒸馏水，ml 二苯胺试剂,ml OD595 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0 5 2.0 0 4.0 号 样品1 2.0 0 4.0 样品2 2.0 0 4.0
动物组织核酸的分离纯化及鉴定
1. 猪肝DNA和RNA的分离 2. 核糖和脱氧核糖的显色实验
3. 核酸的定量和纯度测定
核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内， 是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式—— 核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储 存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可 缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等 现象起着重要的决定作用。核酸分为两大类——核糖核 酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 。 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖 或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核 苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖， 一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷 酸。核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴 定。
DNA和RNA的结构
组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。
核酸的分离与纯化
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸分离与纯化
核酸的分离和纯化
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1.2 核酸分离与纯化的要求
(1) 为保证核酸的完整性，
化学因素？ 生物因素？ 物理因素？
（防止降解），在实验中应注意：
① 尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种 有害因素对核酸的破坏。
② 减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。
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③ 防止核酸的生物降解（细胞内或外的 各种核酸酶水解）。
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除 去，不影响以后实验。
缺点： 需要量大，一般要求低温操作。
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异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA 样品沉淀。一般不需低温长时间放置。
缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥
发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
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使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈
现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提 实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操
作时应戴手套。
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③ 去除对后续实验有影响的物质，如有机 溶剂和过高浓度的金属离子。
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2. 核酸制备的基本步骤
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
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2.1 破碎细胞
核酸分离纯化实验报告单
实验名称：核酸分离纯化实验实验日期：2023年X月X日实验地点：实验室一、实验目的1. 学习核酸分离纯化的原理和方法。
2. 掌握DNA和RNA的提取、纯化技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理核酸分离纯化是指将DNA和RNA从细胞或组织样品中提取出来，并去除其中的蛋白质、多糖、脂类等杂质。
常用的方法有苯酚-氯仿法、柱层析法、磁珠法等。
三、实验材料1. 样品：细胞或组织样品2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS、酚、氯仿、异戊醇、LiCl、无水乙醇等3. 仪器：离心机、移液器、试管、烧杯、磁力搅拌器等四、实验步骤1. 样品处理将细胞或组织样品加入Tris-HCl缓冲液和EDTA，加入SDS，充分混匀，高温处理，使蛋白质变性。
2. 离心将混合液离心，取上清液。
3. 脱蛋白在上清液中加入酚和氯仿，充分混匀，静置，离心。
4. 回收核酸将上层水相转移到新的试管中，加入LiCl，充分混匀，静置，离心。
5. DNA/RNA沉淀将上清液转移到新的试管中，加入无水乙醇，充分混匀，静置，离心。
6. 洗涤弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，离心。
7. 干燥弃去上清液，将沉淀干燥。
8. 溶解将干燥的DNA/RNA沉淀用Tris-HCl缓冲液溶解。
五、实验结果通过以上步骤，成功提取并纯化了DNA和RNA。
在紫外分光光度计下检测，A260/A280值在1.8-2.0之间，说明DNA/RNA纯度较高。
六、实验讨论1. 实验过程中，样品处理和离心速度对DNA/RNA的提取和纯化有较大影响。
样品处理要充分，离心速度要适中，以确保DNA/RNA的完整性和纯度。
2. 在脱蛋白过程中，酚和氯仿的加入量要适中，过多会影响DNA/RNA的提取和纯化。
3. 在DNA/RNA沉淀过程中，无水乙醇的加入量要适中，过多会导致DNA/RNA沉淀不完全，过少则会影响DNA/RNA的溶解。
4. 实验过程中，要注意实验操作的规范性和无菌操作，以防止DNA/RNA的污染。
核酸提取纯化方法
核酸提取纯化方法引言核酸提取是分子生物学研究中的一个重要步骤，它主要包括纯化 DNA 和 RNA 两种核酸的过程。
在研究领域，纯化高质量的核酸样品对于准确分析和解读生物信息至关重要。
本文将介绍几种常用的核酸提取纯化方法，包括酚-氯仿法、离心柱法和磁珠法，并对每种方法的优缺点进行评述。
1. 酚-氯仿法酚-氯仿法是一种传统的核酸提取纯化方法，它基于核酸在酚和氯仿两相体系中具有不同溶解度的原理。
具体步骤如下：1.收集待提取的样品，如细菌培养物或组织样品。
2.加入等体积的酚-氯仿溶液，同时加入破碎剂（如玻璃珠或硅胶），彻底混合。
3.离心样品，使得酚相和氯仿相分离。
4.分离上层透明的水相，其中富含 DNA 或 RNA。
5.加入冷异丙醇或乙醇，沉淀核酸。
6.通过离心将沉淀的核酸分离。
7.用缓冲液溶解核酸沉淀，获得纯化后的 DNA 或RNA 样品。
酚-氯仿法提取的核酸样品质量较高，适用于小规模样品的提取。
然而，由于该方法对操作者的技巧要求较高，并且在操作过程中可能存在酚和氯仿对人体的损害风险，所以目前已逐渐被离心柱法和磁珠法取而代之。
2. 离心柱法离心柱法是一种基于硅胶膜和纤维素膜的核酸提取纯化方法，凭借其简单、快速和高效的特点已经成为目前最常用的核酸提取方法之一。
具体步骤如下：1.添加细胞裂解缓冲液到待提取样品中，通过细胞裂解将核酸释放到溶液中。
2.准备离心柱，将离心柱放入收集管中。
3.将样品溶液加到离心柱中，使其通过硅胶膜或纤维素膜。
4.通过洗涤液洗去杂质。
5.加入低盐缓冲液或水，洗脱核酸。
6.将洗脱的核酸收集到新的收集管中。
离心柱法的优点在于简单、快速且对样品的处理量较大，能够同时提取多个样品。
然而，该方法对于某些特殊样品（如富含多酚化合物或多糖的样品）可能会产生一定的干扰。
3. 磁珠法磁珠法是一种新兴的核酸提取纯化方法，它利用了磁珠的磁性和高亲和性，能够快速、高效地提取纯化核酸。
具体步骤如下：1.准备磁珠混悬液，并加入样品。
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教学秘书 教研室主任 教学院长 制表日期
2015-2016学年第二学期
2013级临床医学八年制《基因工程实验技术》教学日历 教室安排:8号楼三楼 分子生物学实验室 （27学时） 116人
第一实验室: 喻红/杜芬 (39); 第二实验室: 张百芳/汪敏(39); 第三实验室: 苗丽霞/范成鹏(38)
2016年 课 程 内 容
学时 4月17日 周日 1. 概述基因工程基本流程及在医学中的应用（目的基因的获取；质粒载体在基因工程中的应用；重组体的连接(重
点：质粒PCR 定点突变及TA 克隆)、转化；筛选转化子的方法；原核表达体系及真核表达体系，外源基因的
表达和产物分离纯化；亚克隆；基因工程与医学实践的结合; PAGE 电泳和层析技术的介绍）；
2. 提供细菌A 液提取的质粒DNA 经PCR 定点诱变后的产物纯化溶液；提供T 载体Kit ，进行连接反应；
3. 制备含Amp 的LB 固体培养平皿；
4. 提供感受态DH5a ，将重组连接后的DNA 溶液转化、Amp 平板铺菌，培养过夜（<18h,下午开始做）（周一课
间来观察转化结果：Amp 筛选平板上的单菌落，或-4度密封保存平板至下周六）
5. 提供小量液体培养过夜的细菌B 液；转新锥形瓶，液体培养3-4h 后加IPTG 1mM 诱导表达（5h ），收集诱导
后的菌体沉淀（诱前0.5ml 两管，诱后1ml 两管和3-4ml 的若干管，用于目标蛋白的纯化）
6. 重组质粒DNA 的质粒提取及限制性内切酶双酶切图谱的鉴定（周日下午做，过夜，周一转存-20度冰箱）；
9 4月23日 周六 1. 原核表达体系中GST 融合蛋白的诱导表达及鉴定：先进行SDS-PAGE 的灌制凝胶；再将诱导前后的菌体蛋白，
进行SDS-PAGE 检测外源蛋白的诱导表达水平；
2. Western Blotting 鉴定特异蛋白的表达水平（SDS-PAGE （第一块胶）、转膜、封闭、I 抗（抗GST-Ab ）孵育过夜）；
3. 外源GST 融合蛋白的分离纯化（介绍层析技术；上午开始做）：诱导后的细菌沉淀采用溶菌酶法裂解细菌（>1h ），
Glu-Agarose beads 亲和层析法分离纯化GST 融合蛋白（提供50 ul beads ，Ep 管离心洗涤法，每班共10组），
4. SDS-PAGE 鉴定GST 融合蛋白纯化（下午跑第二块胶，考马斯亮蓝染色>0.5h ，漂洗脱色过夜）
9 4月24日 周日 1.
酶切目的DNA 片段的非变性PAGE 鉴定 2.
Western blotting （续）：洗膜、II 抗孵育1~2 h ，漂洗、DAB 显色。
3.
SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色后的脱色结果观察 4. 实验报告与总结，结果分析及讨论：（真核基因在原核生物中的表达策略）
9。