可溶性蛋白质含量的测定电子教案
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。
双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。
干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
2.福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(ＦolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。
ＦolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。
此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
【仪器与用具】试管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。
【试剂】NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；浓HCl；LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。
所用试剂均为化学纯或分析纯。
【方法】1试剂的配制(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4％碳酸钠(NA2CO3)溶液与02Mol／L氢氧化钠(NAOH)溶液等比例混合(2％NA2CO3，01Mol NAOH)；B液：1％硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(05％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。
在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。
此为ＦolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于ＦolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450Ml，浓HCl 100Ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。
冷却后加入硫酸锂(LI2SO4·H2O)150g，水50Ml，溴水2～3滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。
待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。
使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol／L H ＋酸，此为ＦolIn－酚试剂乙液(ＦolIn试剂)。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
（2）标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白，溶于100Ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg／Ml。
2标准曲线的绘制（1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。
(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。
(3)在每支试管中喷射加入05Ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。
(4)准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM 光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。
以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3样品的测定(1)样品的提取：称取鲜样05g，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。
取10Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
(2)根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。
4结果计算样品中蛋白的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-1）式中C:查标准曲线值(μg)；VT:提取液总体积(Ml)；ＦW:样品鲜重(g)；V1:测定时加样量(Ml)。
【注意】还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
方法二：考马斯亮蓝G－250染色法【原理】考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G －250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比ＦolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
【仪器与用具】721分光光度计；10Ml量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具塞刻度试管14支。
【试剂】标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／Ml的标准蛋白溶液;90％乙醇；85％磷酸(W／V)；考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。
【方法】1标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／Ml)的绘制取6支具塞试管，按表2－1数据配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。
表2－1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表管号123456蛋白质标准液（ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水（ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（μg）020*********在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液1.0Ml(样品提取见LoWry 法)，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
3结果计算样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000（2-2）式中C：查标准曲线值(μg)；VT：提取液总体积(Ml)；ＦW：样品鲜重(g)；V1：测定时加样量(Ml)。
植物叶片可溶性蛋白含量测定注意点：1，考马斯亮蓝G-250所配溶液不稳定，所以每次实验都必须新配，且必须新做标准曲线；2，考马斯亮蓝G-250配制完毕，如果发现溶液中有絮状沉淀，可以试用滤纸过滤后使用，如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝G-250溶液在与样品接触后短时间内便又发生絮凝，基本上推测该考马斯亮蓝G-250过期（比较容易出现）。
原理植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。
因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验8 植物组织中可溶性卵白质含量的测定之答禄夫天创作Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与卵白质的反应,其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下, 与铜试剂作用生成卵白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原, 生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物, 颜色深浅与卵白含量成正相关.在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍.由于肤键显色效果增强, 从而减少了因卵白质种类引起的偏差.该法适于微量卵白的测定(范围为5～l00μg卵白质).[资料、仪器设备及试剂](一)资料各种植物资料.(二)仪器设备 722分光光度计, 离心机, 恒温水浴, 定量加样器, 冷凝回流装置一套, 研钵, 离心管, 刻度移液管, 微量滴定管,试管等.(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H. (2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合.B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合.使用前将A与B按50:1的比例混合即成, 此试剂只能在使用当天配制.(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04.H20)100g, 钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g, 加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中.之后加入85％的H3PO450mL, 浓Hcl 100 mL, 安上回流装置(使用磨口接头, 若用软木塞或橡皮塞时, 就必需用锡铂纸包起来), 使其慢慢沸腾10h.冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml, 溴水2-3滴, 翻开瓶口煮沸15min, 以逐出过量的溴, 冷却后溶液呈黄色（若仍绿色, 须再滴加几滴溴水, 继续煮沸15min）.待冷却后稀释至1000ml, 过滤入棕色瓶中保管.使用时年夜约加水1倍, 使最终浓度相当于1mol/L酸度.因此在使用前应进行标定.标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内, 用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定, 酚酞作指示剂, 当溶液突然转红再转灰绿时, 即为滴定终点.计算其相当的酸度, 用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L的酸度. 在测按时要注意, 因为酚试剂仅在酸性稳定, 但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生, 所以当加酚试剂时, 必需立即混匀, 以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应, 否则会使显色水平减弱.⑷标准卵白质溶液：称取25mg牛血清卵白, 溶于100ml蒸馏水中, 使终浓度为250μg/ml.[实验步伐]（一）标准曲线的绘制（1）取18mm×200mm试管7支, 1-7编号, 分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准卵白质溶液,用蒸馏水补足1mL, 使每管含卵白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmo l/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L.（2）用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液, 混匀, 于30℃下放置10min.（3）再向试管中喷射加入0.5mL乙液, 立即振荡混匀, 在30℃下准确保温30min（4）以不加标准卵白的1号管为空白, 在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度.以标准卵白浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线.(二)样品的测定样品的提取：称取鲜样0．5g, 用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后, 10000 r／min离心10min, 取上清液1．0mL（视卵白质含量适当稀释)于试管中, 然后重复标准曲线绘制中的2～4步伐, 以空白管调零, 测定吸光度.根据吸光度查标准曲线, 求出样品中的卵白质含量.[结果计算] 样品中卵白的含量＝ (mg／g) 式中：C为查标准曲线值, μg；VT为提取液总体积, mL；WF为样品鲜重, g；Vs为测按时加样量, mL. '注意事项还原物质, 其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰.Ⅱ．考马斯亮蓝G-250染色法[原理] 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定卵白质含量属于染料结合法的一种.该染料在游离状态下呈红色, 在稀酸溶液中当它与卵白质的疏水区结合后酿成青色, 前者最年夜光吸收在465nm, 后者在59511nm.在一定卵白质浓度范围内(1～1000μg), 卵白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与卵白质含量成正比, 故可用于卵白质的定量测定.考马斯亮蓝G-250与卵白质结合反应十分迅速, 2min左右即到达平衡.其结合物在室温下1h内坚持稳定.此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍), 易于把持, 干扰物质少, 是一种比力好的定量法.其缺点是在卵白质含量很高时线性偏低, 且分歧来源卵白质与色素结合状况有一定不同.[资料、仪器设备及试剂](一)资料小麦叶片及其他植物资料.(二)仪器设备 722分光光度计, 研钵, 烧杯, 量瓶, 移液管, 具塞刻度试管等.(三)试剂(1)标准卵白质溶液：100μg／mL牛血清白卵白：称取牛血清卵白25μg, 加水溶解并定容至100mL, 吸取上述溶液40mL, 用蒸馏水稀释至100mL即可.(2)考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250, 溶于50mL 90％乙醇中, 加入100mL 85％(W／V)的磷酸, 再用蒸馏水定容到1L, 贮于棕色瓶中.常温下可保管一个月.[实验步伐](一)标准曲线的绘制取6文具塞试管, 按表2-29-1加入试剂(0～100μg／mL的标准卵白).混合均匀后, 向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 摇匀, 并放置5min左右, 用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度.以卵白质浓度为横坐标, 以吸光度为纵坐标绘制标准曲线.(二)样品测定(1)样品提取.方法与斐林-酚试剂法相同.(2)吸取样品提取液1．0mI, 放人具塞试管中(每个样品重复2次), 加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液, 充沛混合, 放置2min后在595nm下比色, 测定吸光度, 并通过标准曲线查得卵白质含量. [结果计算] 样品中卵白质的含量＝ (mg／g) 式中：C、VT、WF、Vs的暗示意义与斐林-酚法相同.Ⅲ．紫外吸收法[原理] 卵白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最年夜光吸收.由于各种卵白质中都含有酪氨酸, 因此280nm 的光吸收度是卵白质的一种普遍性质.在一定水平下, 卵白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比, 故可作定量测定.核酸在紫外区(260nm)也有吸收, 可通过校正加以消除.[资料、仪器设备及试剂](一)资料．小麦叶片及其他植物资料.(二)仪器设备紫外分光光度计, 离心机, 刻度移液管.(三)试剂 0． 1mol/L PH 7．0磷酸缓冲液.[实验步伐]（一）样品提取与菲林-酚法相同.（二）测定取适量的样品提取液, 根据卵白质浓度, 用0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液适当稀释后, 用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度, 以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零.[结果计算] 卵白质浓度=1.45A280-0.744A260（mg/mL）卵白质含量= 式中：1.45和0.74为校正值：A280为卵白质溶液在280nm处的吸光度；A260为卵白质溶液在260nm处的吸光度；n 为稀释倍数.思考题 1．测定植物体内可溶性卵白质含量有什么意义和用途?试举二例说明.2．三种测定方法各有何优缺点?在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点?3．福林-酚试剂法测定卵白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题?。
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。
待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。
因此在使用前应进行标定。
实验二、园艺产品可溶性蛋白质含量的测定
三、实验用品 材料 : 菜豆 仪器设备: 分光光度计、研钵 离心管、 烧杯，试管 10000转/分离心机 试剂：牛血清白蛋白 考马斯亮蓝 85％磷酸 95%乙 醇 (1)标准蛋白质溶液： 称取牛血清蛋白100mg，加水 溶解于100ml蒸馏水中，即为1000 μg /ml的溶液。
（2）考马斯亮蓝试剂 称取25mg考马斯亮蓝G-250， 溶于25ml95％乙醇中；加入50ml 85％(W／V)磷酸 中，再用蒸馏水定容到500ml，贮于棕色瓶中。常 温下可保存1个月。
弃去沉淀，上清液转入量瓶，以蒸馏水定容至50～ 100ml待测。（上清液备用）
2．测定： 吸取提取液0.5ml、蒸馏水0.5ml 放入试管中， （需用另一试管重复一次）， 再加入5ml考马斯亮蓝G—250蛋白质试剂， 充分混合放置2分钟后在595nm下比色记录消 光值，以一号作空白。3．结果计算：
四、 实验方法和步骤
（一）标准曲线的制作 取6支试管，按下表配制0—1000微克/ml牛血清白蛋白溶液各 1ml。
向上述试管中，分别加入5ml考马斯亮蓝G—250蛋白试剂， 将试管中溶液混合，放置2分钟后在595nm下比色，作标准曲 线。
（二）样品提取液中蛋白质浓度的测定 1．取样： 称取新鲜样品0.25～0.5克，放 入研钵中，加5ml蒸馏水研成匀桨，转移到 离心管中，然后在4000转/分， 离心10分钟，
实验三、
园艺产品可溶性蛋白质含量的测定
一、实验目的要求
学习使用考马斯亮蓝G—250法测量蛋白质含量
二、原理
考马斯亮蓝G-250法是利用蛋白质—染料结合染色 的原理， 定量的测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的 方法。考马斯亮蓝G—250在游离状态下呈红色，与蛋白 质结合后为蓝色。最大光吸收由465 nm变成595 nm，通 过测定595nm处光吸收的增加量,可知与其结合蛋白质的 量。
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。
常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。
方法一：LoWry法(劳里法)【原理】LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。
其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。
再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。
这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。
LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。
LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。
但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。
且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约以上。
实验6可溶性蛋白质的测定
水（mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量
（μg）
0 20 40 60 80 100
取6支10mL具塞试管，按上表加入试剂 ，混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮 蓝G-250溶液，稀释至刻线10mL（则蛋白质
浓度分别为0、2、4、6、8、10μg/mL ），
摇匀，放置5min后于595nm波长下比色。以 蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘 制标准曲线。
3. 实验材料、仪器与试剂 材料：豆芽 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶
，移液管，具塞刻度试管，研钵，漏 斗，铁架台，玻璃棒。 试剂：考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，磷酸， 牛血清蛋白。
试剂配制： 考马斯亮蓝G-250试剂：称取0.1000g考马斯 亮蓝G-250，溶于50mL95%乙醇中，加入 85%磷酸100mL，用蒸馏水定容至1000mL。
左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速 ，其结合物在室温下1h内保持稳定。
考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比 较缓慢，但可以被洗脱下去，所以可用来对 电泳条带染色。
（3）样品的测定
另取3支10mL具塞试管，分别吸取样 品溶液0.6mL，各加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，稀释至刻线10mL，充分混合， 放置5min后于595nm波长下比色，测定吸 光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
5. 结果计算
蛋白质含量（%）=
C×V2×V0 m×V1
× 100
式中： C——从标准曲线上查得的蛋白质浓度，g/mL
标准蛋白质溶液（100μg/mL）：称取
0.ห้องสมุดไป่ตู้100g牛血清蛋白（BSA），溶于100mL蒸 馏水中。
4. 实验步骤 （1）样品处理：
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定(精)
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ 考马斯亮蓝 G – 250 染色法一、原理考马斯亮蓝 G – 250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。
（二）试剂1. 标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。
2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制取 6 支试管，按表 26–1 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。
植物衰老生理实验（可溶性蛋白含量）
一、实验目的和要求：（1）了解掌握可溶性蛋白测定的方法。
（2）掌握用离心机、分光光度计的基本方法和步骤。
二、实验内容和原理：内容：植物组织中可溶性蛋白的测定原理：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。
在595nm 处有最大吸收峰。
02468100.000.050.100.150.200.250.300.35Protein content ( g)A b s o r b a n c e 三、主要仪器设备和材料试剂：材料：叶龄差异明显的叶片（新叶、老叶）仪器：离心机、分光光度计器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、研钵、电子天平、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）、考马斯亮蓝四、操作方法与实验步骤：称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心15min ，取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，冰箱保存。
剩余上清液取20-50ul 加入5ml 考马斯亮蓝，595nm 比色。
五、实验数据记录和处理：取595nm的OD值平均后可得，新叶1.125，老叶0.423上清液总体积：新叶5.0ml，老叶5.0ml将595nmOD值带入标准曲线Y=-0.00381+0.032029*X得到新叶蛋白质质量=(1.125+0.00381)/0.032029=35.24μg老叶蛋白质质量=(0.423+0.00381)/0.032029=13.32μg可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=(m*v/v’)/W新叶可溶性蛋白含量=(35.24*5/0.05)/1.00=3524.00μg/g.FW老叶可溶性蛋白含量=(13.32*5/0.05)/1.00=1332.00μg/g.FW六、实验结果与分析：实验分析：新老叶可溶性蛋白含量有明显的差异，新叶的可溶性蛋白含量明显高于老叶可溶性蛋白含量，由此可知：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。
实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝g-250法).
表-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管号
123456
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml)
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量(mg)
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
实验步骤
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表 28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与 步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。
Protein content ( g)
注意事项
1 由于取的组织不同，所以 OD值相 差较大。
2 研磨须充分，否则溶解后析光时所 得数据并不是1克植物量对应值。
3 标准溶液的测定实验组同时进行， 以免引起误差。
取植物叶片0.1-0.2剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入 10ml 离心管中，定容到10 ml，10000 pm离心， 20min 得上清液作为待测样品。
可溶性蛋白含量测定法(考马斯亮蓝染色法)
.可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝染色法）1. 试剂配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）磷酸，再用蒸馏水定容到1L。
在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。
90% 乙醇配制：95%乙醇和75%乙醇按3:1体积比混合配制，即95%乙醇37.5ml，75%乙醇12.5ml或取45ml无水乙醇直接定容至50ml。
（2）100 g/ml 牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取10mg BSA定容至100 ml即为100 g/ml。
或称取25 mg BSA加蒸馏水水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40 ml蒸馏水定容至100ml。
（3）0.05 mol/L，pH7.8磷酸配制：A母液，0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO 412H2O (分子量358.14)35.85 g，用蒸馏水定容至500 ml。
B母液，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O (分子量156.01)1.5601 g，用蒸馏水定容到50 ml。
0.05M pH7.8磷酸：分别取A母液228.75ml，B母液21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 标准曲线绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min 左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂0号1号2号3号4号5号标准蛋白体积/ml0.000.200.400.600.80 1.00蒸馏水体积/ml 1.000.800.600.400.200.00蛋白质含量/g020*********3. 样品测定（1）样品提取：取鲜样0.2—0.5g，用蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min—4000r/min 离心10min，上清液备用。
（2）吸取样品提取液1.0ml（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复两次），加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min带反应完成，在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查蛋白质含量。
可容蛋白含量测定
植物生理学模块实验指导李玲主编科学出版社可溶性蛋白含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】掌握考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量的基本原理和方法。
【实验原理】蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在此基础上发展了蛋白质染色测定方法，涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
考马斯亮蓝是目前广泛使用的染料之一。
考马斯亮蓝G-250（Goomassie brilliant blue G-250）是测定蛋白质含量的一种染料。
该染料依其存在形式的不同表现为红色和蓝色，游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质结合后可变为蓝色，2~5min后在595nm处具有最大光吸收，可以稳定1h以上。
蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量（1~1000μg）呈正比，所以，利用这一特征进行蛋白质的定量测定。
该方法简便迅速、消耗样品量少、重复性好，但是不同种类的蛋白质之间差异大，当蛋白质含量偏高时，标准曲线线性较差。
【器材与试剂】1.实验仪器与用具电子天平、分光光度计、离心机、研钵、刻度试管及试管架、移液管、容量瓶2.实验试剂考马斯亮蓝G-250染色液：称取考马斯亮蓝100mg，用50ml 95%乙醇溶解，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1L，储于棕色瓶中。
标准蛋白溶液（0.1mg/ml）：称取10mg牛血清蛋白，用0.9%的氯化钠溶解，定容至100ml。
3.实验材料苹果、梨、香蕉、柑橘等果实【实验步骤】1.取7支试管，按照表1加入试剂。
混合摇晕，放置5~20min。
用分光光度计测定OD595值。
以OD595为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表1 考马斯亮蓝法标准曲线的各种试剂加入量0 1 2 3 4 5 6牛血清蛋白(mg/ml)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水（ml） 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 52. 称取果肉样品2g放入研钵中，加2ml蒸馏水研磨成匀浆，移到离心管中，用6ml蒸馏水分次洗涤研钵，转移至林新馆中，4000r/min离心15min，上清液转入容量瓶，蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。