病毒感染的实验诊断
病毒感染实验诊断
病毒感染实验诊疗1.（ 1 ）一般原则是特异敏感、迅速和简易。
第一依据流行病学和临床特色，初步判断可能感染的病毒。
（2）而后依据可疑病毒的生物学特色、机体免疫应答和临床过程，以及病人目前所处的机遇，确立实验诊疗方法。
2.（1）对潜藏期短，发病时还没有抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。
（2）对潜藏期超出十天的感染，可检测特异性的 IgM 抗体来进行早期迅速诊疗，及差别首次和再次感染。
（3 ）对可在体内形成连续感染或潜藏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无 4 倍以上涨高，或直接检测病毒核酸。
（4）对原由不明或有新病毒感染时，应收集标本进行病毒分别，同时应采纳双份血清以确认分其余病毒为病原体。
（5）对同一症状可有多种病毒惹起的状况，应同时检测几种有关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。
（6）对由多个型别构成的病毒可测定它们的共同抗原。
第一节标本收集与运送一、标本的收集1.采样时间：尽可能在发病的早期，急性期或患者人院的当日进行。
2.标本种类的选择：依据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感得病毒种类，选择相应部位采纳标本。
常有分别病毒标本的选择：3．常有标本的收集方法(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml 。
抗凝采纳100n ／ ml 肝素钠。
用于分别CMV 、HSV ，、黄病毒、 EBV、 HIV-1及重生儿肠道病毒。
(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液 1 ～ 2ml ，冰浴立刻送检。
在 4 ℃可寄存72h 。
用于分别柯萨奇病毒、 ECHO 病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。
(3) 宫颈或阴道拭子：采纳病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm 逗留 5 秒拿出，冰浴立刻送检。
用于分别HSV 、 CMV 。
(4)粪便标本：取 2 ～4 ｇ粪便加 10ml 运送液立刻送检，用于分别腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。
(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。
用于分别流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV 等。
EB病毒感染实验室检测方法
EB病毒感染实验室检测方法摘要本文档详细描述了EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的实验室检测方法，包括病毒培养、血清学检测、核酸扩增和病毒载量测定等。
这些检测方法在临床诊断、流行病学研究以及疫苗研发等领域具有重要意义。
1. 病毒培养1.1 原理EBV属于疱疹病毒科，是一种专性细胞内寄生的DNA病毒。
病毒培养可以充分展示病毒的感染性、复制能力和生物学特性。
1.2 方法1. 选择合适的细胞系，如B95-8或Daudi细胞。
2. 将临床样本（如唾液、血液等）接种至细胞系。
3. 在适宜的条件下（如37°C、5% CO2）培养细胞，观察病毒复制和感染现象。
4. 定期观察细胞病变，如细胞增大、核固缩等。
5. 采用免疫荧光染色、电子显微镜等方法检测病毒颗粒。
2. 血清学检测2.1 原理血清学检测基于病毒感染后诱导的免疫反应，通过检测特异性抗体来诊断EBV感染。
2.2 方法1. 收集患者血清样本。
2. 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EBV特异性抗体，如VCA-IgM、VCA-IgG、EA-IgG等。
3. 采用免疫荧光染色、免疫组化等方法进行抗体检测。
4. 根据抗体类型和滴度判断感染状态，如急性感染、慢性感染或回忆性感染。
3. 核酸扩增3.1 原理核酸扩增技术通过特异性引物和DNA聚合酶酶链反应（PCR）来检测EBV的DNA序列。
3.2 方法1. 提取临床样本的DNA。
2. 设计针对EBV DNA的特异性引物，进行巢式PCR或实时定量PCR（qPCR）。
3. 扩增EBV特异性基因，如EBNA1、EBNA2、LMP1等。
4. 分析扩增产物，判断病毒感染情况。
4. 病毒载量测定4.1 原理病毒载量测定通过检测病毒颗粒的数量来评估病毒感染的程度。
4.2 方法1. 提取临床样本的病毒颗粒。
2. 采用实时定量PCR、定量荧光显微镜等方法测定病毒载量。
3. 根据病毒载量判断感染程度，为临床治疗提供依据。
病毒感染的诊断新技术
病毒感染的诊断新技术
随着科技的不断进步，病毒感染的诊断技术也在不断升级，为临床诊断提供了更加快速准确的手段。
传统的病毒感染诊断方式主要依靠症状、临床表现和实验室检测，然而这些方法往往耗时且准确率有限。
因此，研究人员们不断探索创新，希望能够开发出更加高效的诊断技术。
一、核酸检测技术
核酸检测技术是当前用于病毒感染诊断的主流方法之一。
通过提取患者样本中的核酸，例如血液、唾液、尿液等，再检测其中是否含有特定病毒的遗传物质。
这种方法的优势在于高度准确和灵敏度高，能够及时发现病毒感染。
近年来，一些快速核酸检测设备的出现更加方便了诊断工作，大大缩短了诊断的时间。
二、免疫学检测技术
免疫学检测技术在病毒感染的诊断中也扮演着重要角色。
这种方法利用人体免疫系统对病毒感染产生的抗体或抗原进行检测，从而确定患者是否感染了特定的病毒。
免疫学检测技术包括ELISA、免疫印迹等方法，其优势在于可以快速筛查大量样本，对于群体性的感染疫情具有重要意义。
三、基因测序技术
随着基因测序技术的不断发展，其在病毒感染诊断中的应用也日益广泛。
通过对病毒基因组的测序分析，可以快速确定感染病毒的种类和亚型，为病毒溯源和病毒演化提供重要信息。
基因测序技术不仅可以帮助医生更好地制定治疗方案，还能够为疫情防控提供科学依据。
综合以上几种新技术，可以看出病毒感染的诊断已经迈入了一个新的时代，诊断速度更快、准确度更高。
然而，我们也需要意识到新技术的应用仍然面临一些挑战，如设备成本高、技术人员需求等。
因此，未来的诊断技术发展仍需不断努力，以推动临床诊断水平的提升，为保障公共健康做出更大贡献。
病毒性感染的血清学诊断
病毒性感染的血清学诊断检查受微生物感染的机体有无特异性抗体，称为血清学诊断。
利用抗原与抗体能发生特异性结合的特点，用已知的病毒抗原检测患者血清中相应抗体，是病毒血清学诊断的基本原理。
对病毒性感染的血清学诊断最常用的办法是中和实验、补体结合实验、血凝抑制实验等，其中中和实验最为常用。
用动物、鸡胚和细胞培养均可举行。
中和实验多采纳细胞培养办法举行测定，其原理是将系列稀释的血清与病毒液混合后，再分离感染细胞，测定病毒的感染性，观看血清对细胞的庇护作用。
假如细胞不浮现病变，则证实血清中有病毒特异抗体存在。
效价凹凸是以能庇护半数细胞不产生CPE的血清最高稀释倍数来表示。
用此实验可检测患者血清中抗体的消长状况，常用于病毒感染的流行病学调查；也可用来鉴定未知病毒或讨论病毒的抗原结构。
下面以单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）为例，介绍细胞培养法中和实验来测定抗中和抗体，包括蚀斑削减法和细胞病变法。
一、蚀斑削减法测定中和抗体【材料】 1．待测血清无菌采集受检者末梢血5m1置离心管中，凝固后2000r/min离心5分钟，吸血清，经56℃灭活30分钟后冰箱冻存。
2. HSV-1型病毒（预测定PFU)。
3. Vero单层细胞培养皿（60mm）或培养瓶14支。
4. PBS、培养基A液、B液和C液等，配制办法同空斑定量法。
5．无菌试管、各种吸管（2ml,lml,5ml)、无菌注射器及离心管（10ml)。
【办法】 1．待测血清稀释取7支小试管，按表8-5倍比稀释血清。
2．病毒稀释将HSV-1型病毒稀释，使其浓度为1000PFU/ml, 3．取各稀释度血清0.5 ml加入试管中，各管中分离再加入0.5 ml病毒液（1000PFU/ml)，混匀后37℃作用1小时。
4．取各管血清与病毒混合物0.2m1，分离加入单层培养Vero细胞培养皿（瓶）中，每稀释度接种2支平皿（瓶），加预温A,B混合培养液4m1，凝固后反转培养3～4天后，再加C液(1％中性红琼脂培养基）2m1，凝固后培养数小时或过夜，测定各平皿（瓶）的空斑数。
病毒感染的实验诊断
病毒感染的实验诊断● 考点病毒的生物学性状病毒的实验室检查方法常见病毒的感染【内容讲解】第一节概述一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。
仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。
病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。
在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。
一、病毒的基本性状（一）形态结构1.大小和形状：大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。
形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。
2.结构（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。
病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。
异常增殖：顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。
缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。
干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。
（三）噬菌体以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。
噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。
噬菌体感染细菌后产生两种后果：溶菌周期和溶源性周期。
（四）非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。
朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。
朊粒致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病（疯牛病）。
克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。
二、病毒的分类与命名科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。
DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。
按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。
按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。
感染性疾病的实验室诊断
感染性疾病的实验室诊断感染性疾病的实验室诊断介绍实验室检查可直接对微生物进行检测（如：肉眼观察、利用显微镜观察、病原体在培养基上生长）或者间接对微生物进行检测（如抗体检测）。
一般的检测手段包括·显微镜检查( 显微镜检查)·培养(培养)·免疫学试验（凝集反应试验如乳胶凝集试验、酶免疫测定、蛋白质印迹、沉淀试验、补体结合试验）免疫学试验·核酸为基础的鉴定方法( 以核酸为基础的鉴定方法)·非核酸鉴定方法( 以非核酸为基础的鉴定方法)培养通常是明确微生物的金标准，但是结果可能要在数天或数周后才能得到，并且不是所有的病原体都可以通过培养得到，因此可以选择其他有参考价值的试验。
当一种病原体得到培养及鉴定后，实验室就可以评估其对抗微生物药物的敏感性药敏试验。
有时也可以用分子生物学的方法来检测特定的耐药基因。
一些试验（如革兰染色，常规的需氧培养）可以检出多种病原体，并且通常在许多可疑的感染性疾病的诊断中被使用。
然而由于通过这些试验可能使得一些病原体被遗漏，因此临床医生必须知道对每种可疑病原体检测所用的每个试验的局限性。
当出现可能被遗漏的情况时，医生需要对怀疑的病原体进行特异性的检测（如特异染色或特异培养基）或建议实验室选择更多有针对性的试验进行检测。
显微镜检查显微镜检查速度快，但是准确性有赖于检测者的经验以及检测设备的质量。
除标准的实验室外，由于质控方面的不足常常限制了医生选择显微镜检查作为确诊的方法。
组织的显微镜检查可能需要区分病原微生物来自于侵袭性疾病或仅仅为表面定植－这种区分往往难以由培养来判别。
虽然有一些不能被染色的标本要通过水分固定来检出真菌、寄生虫（包括蠕虫的卵和幼虫）、阴道来源细胞和能动的微生物（如毛滴虫属）、梅毒螺旋体（通过暗视野显微镜），但是大多数标本用染剂处理后都能使病原体带有颜色，让它们在背景中突显出来。
为了提高真菌的可分辨度，可用10%氢氧化钾（KOH）溶解周围的组织和非真菌病原体。
感染性疾病的实验诊断
感染性疾病的实验诊断感染性疾病是指由病菌、病毒、真菌、原虫等微生物引起的疾病。
实验诊断是感染性疾病诊断的重要手段之一。
本文将介绍常见的感染性疾病实验诊断方法。
细菌感染细菌培养和鉴定细菌培养和鉴定是诊断感染性疾病的基础。
常用的方法有纸片法、液体培养法和固体培养法。
在细菌培养和鉴定时，需要注意以下几点：•采样部位：不同部位采样，得到的细菌不同。
•采样时间：尽量在发病早期采集样本。
•保存条件：样本应储存于符合条件的、密闭的容器中。
抗生素敏感试验抗生素敏感试验是判断抗生素对某一细菌菌株敏感性的试验。
可通过药敏试验盘或流式细胞术等方法进行。
在进行抗生素敏感试验时，应注意以下几点：•采用标准菌株来验证试验的准确性和重复性。
•必须使用正规化的抗生素品种，且按照规定的剂量和方法进行。
•应注意抗生素的浓度，过低的浓度会导致假阴性结果；过高的浓度会导致假阳性结果。
病毒感染病毒分离和鉴定病毒分离和鉴定是诊断病毒感染的关键步骤。
目前主要采用细胞培养和小鼠接种法两种方法。
进行病毒分离和鉴定时，应注意以下几点：•采用原发细胞株或感受器官移植细胞株进行培养。
•细胞应处于生长旺盛期，纯度高。
•对病毒的分离与鉴定需要进行多次重复实验，以提高结果的可信度。
病毒抗原检测病毒抗原检测是通过检测患者组织、分泌物、血液等中病毒抗原来诊断病毒感染的常用方法。
包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光法等。
在进行病毒抗原检测时，应注意以下几点：•选用专一性强、敏感性高的检测方法。
•检测前应对样品进行处理和处理对病毒的影响，避免假阳性或假阴性结果的出现。
•阴性结果不能完全排除病毒感染的可能性。
真菌感染真菌培养和鉴定真菌培养和鉴定是诊断真菌感染的主要方法之一。
通常采用的方法是直接涂片法、培养法和PCR法等。
在进行真菌培养和鉴定时，应注意以下几点：•采集到的标本应越新鲜越好。
•在取材时应尽量去除异物，避免影响培养结果。
•真菌培养温度和培养时间应符合要求。
病毒感染的实验室诊断
空斑形成单位（PFU）：由一个感染性病毒
体复制形成空斑
4.干扰作用：
病毒感染的快速诊断
1. 光学显微镜 检测病毒感染的细胞中有无包涵体、细胞融合形成。 2. 电子显微镜 法等检 测病毒抗原。 4. PCR技术 基因芯片
病毒感染的实验室诊断
Laboratory Diagnosis of Viral Infection 北京大学医学部
病原生物学系
徐国民
病毒感染的实验室诊断
Laboratory Diagnosis of Viral Infection 标本的采集 （原则同细菌）
病毒的分离培养
病毒感染的快速诊断
病毒感染的血清学诊断
病毒感染的血清学诊断
原理： 病毒或其抗原（已知）+ 抗体（未知） 注意： 恢复期血清抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上才有 诊断意义。 方法：血凝试验，血凝抑制试验，间接血凝抑制试验， 酶联免疫吸附试验，中和试验 抗体效价
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病毒核酸检测技术
病毒的分离培养与鉴定
病毒的分离培养
1.动物接种：最原始的病毒培养方法。 2.鸡胚接种：常用的接种部位有羊膜腔、尿囊腔、绒 毛尿囊膜、卵黄囊等。 3.组织培养：将离体活器官，活组织块或分散的活细 胞加以培养后用于病毒的接种。其中细胞培养是病毒 培养最常用的方法。TCID50, PFU
鸡胚模式图
病毒在细胞培养中增殖 的检测指标
1. 细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）：
病毒在感染的细胞内复制增殖， 引起细胞变性、
坏死脱落或形成多形核巨细胞、包涵体的等形态改变。
2.红细胞吸附：
病毒的基本形态和分类病毒的感染与免疫病毒感染的实验室诊断全
病毒的感染与免疫
病毒的感染方式
水平传播： 通过黏膜表面：呼吸道、消化道、泌尿生殖 道 通过皮肤传播：媒介昆虫叮咬皮肤 医源性传播：经输血、注射、拔牙、手术等
垂直传播： 经胎盘传播 经产道传播
病毒感染的类型
病毒的鉴定－－最后鉴定
中和试验
已知抗体＋待检病毒－→细胞培养－→观察有无细胞病变
交叉保护试验
病毒免疫动物－→2周后，用标准动物作攻击试验 不接种病毒的动物－→2周后，用标准动物作攻击试验
病毒的血清学诊断
标本采集：早期和恢 复期双份血清
急性期单份血清IgM 的测定
双份血清的IgG 的测 定
常用方法 中和试验 补体结合试验 血凝抑制试验 免疫荧光试验 酶免试验 胶乳凝集试验 间接血凝试验
隐性感染：成为病毒携带者；获得免疫 显性感染： 急性感染 持续性感染 慢性感染 潜伏感染： 慢发感染
病毒的致病机制
一、病毒对宿主细胞的直接作用 影响细胞的生命力 杀细胞感染 非杀细胞感染 细胞融合 形成包涵体：有些病毒感染的细胞在普通光学显 微镜下可观察到胞浆或胞核内出现圆形或卵圆形 的斑块状结构 细胞转化 细胞凋亡
互补DNA
RNA:DNA
双股DNA
整合宿主细胞DNA
RNA 逆转录病毒的合成
呼吸道病毒
种类 正粘病毒：
流感病毒 副粘病毒：
麻疹病毒 腮腺炎病毒 风疹病毒 呼吸道合胞病毒
流行性感冒病毒
属正粘病毒科 是引起流行性感冒的病原体 分甲、乙、丙三型 甲型流感病毒常引起流感的大流行
生物学特性
形态结构：球形；属RNA病毒；有包膜
病毒感染的基因检测及诊断
病毒感染的基因检测及诊断随着现代医学技术的不断发展，基因检测已经成为诊断疾病、预防疾病和制定个性化治疗方案的重要手段之一。
特别是在病毒感染方面，基因检测技术为医学专家提供了更准确、更快速和更便捷的诊断方法。
本文将从基因检测技术的原理、病毒感染的临床表现和诊断方法这三个方面来探讨病毒感染的基因检测及诊断。
一、基因检测技术的原理基因检测是指对DNA或RNA进行检测，旨在发现与疾病相关的基因突变或多态性。
基因检测可以通过一系列的实验室测试来确定人类遗传物质的变化。
基因检测可以分为两种类型：一种是直接检测某一具体基因是否有突变；另一种是采用全基因组扫描技术，检测所有基因中的突变。
基因检测技术的主要原理是PCR，即聚合酶链式反应。
PCR可以通过复制DNA使其放大，从而从微量样品中检测目标基因的存在。
PCR技术优点是快速、可靠和灵敏。
此外，新一代测序技术的引入，如灵敏性更高的NGS（下一代测序），使得基因检测更加灵活和高效。
二、病毒感染的临床表现病毒感染是由病毒通过进入宿主细胞体内对宿主细胞的生长影响而引起的。
病毒感染的临床表现多种多样，不同病毒感染对于患者的危害程度也不同。
病毒感染可以引起一系列的症状，包括发热、咳嗽、流鼻涕、疼痛等。
此外，病毒感染也可能导致严重疾病，如艾滋病、克隆氏病毒病（EBV）和乙肝等，这些疾病甚至可能危及患者的生命。
三、病毒感染的诊断方法传统的病毒感染诊断方法主要依靠病毒培养、病毒抗体检测和核酸检测等。
尽管这些诊断方法在某些病毒感染的早期诊断中有一定的优势，但是它们也存在一些缺点，如低敏感度和低特异性等。
而基因检测可以通过检测病毒基因的存在和表达，快速、准确地诊断病毒感染。
目前，基因检测在病毒感染的准确诊断和治疗中发挥了重要作用。
例如，PCR技术已经成功应用于流感、人乳头瘤病毒、乙型肝炎等几乎所有常见病毒的检测。
同时，基因检测还是制定针对个体患者的治疗方案的必备手段之一。
例如，在艾滋病治疗中，通过检测HIV病毒中的基因突变，医生可以制定个性化治疗方案，将治疗效果最大化。
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4℃可保存数小时，-70℃可长期保存 -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标 本 对冷冻标本应避免反复冻融
2.保湿送检
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50%甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM） 含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hank’s液
抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5μ g/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉 菌素
1. 病毒的大小及形态 ：电镜直接观察及测量
2. 核酸类型: 用RNA酶或DNA酶处理病毒。
3. 乙醚敏感试验: 有包膜病毒对乙醚敏感，经乙 醚作用后，失去感染性 4. 耐酸试验 肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳 定，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活
病毒的血清学鉴定
对初步鉴定为阳性的标本均需要用血清学方 法做最后鉴定。 方法：血凝抑制试验、中和试验、免疫荧光 试验、ELISA等。
抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较 一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不 敏感，干扰素可抑制病毒复制。
病毒感染的实验诊断方法
病原学诊断
病毒分离培养 显微镜检查 抗原检测 核酸检测
血清学诊断
抗体检测 IgM、IgG
一、标本采集、运送和处理
（一）标本采集
采集时间：尽早采集（越早越好）
检测IgM，常用于早期诊断。 不需活细胞，比中和试验简单，省时。
（三）IF及ELISA
方法简单、快速、敏感性高。 检测特异性IgM，有助于某些病毒感染的早期 诊断，如：
孕妇羊水中检测IgM型特异抗体：胎儿先天性感染 抗HBc IgM：作为急性HBV感染的指标
（四）血凝及血凝抑制试验
3. 动物接种
常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类 加以选择。 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 流感病毒 鼻腔滴种 用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清
病毒在细胞培养中的表现
1. 细胞代谢作用改变（培养液颜色变化）
正常细胞代谢： 培养液由红变黄
病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变 或更红
2. 细胞形态改变
病毒在细胞内增殖后，使宿主细 胞的形态发生不同程度改变，称 为 细 胞 病 变 效 应 （ cytopathic effect，CPE）。
动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养 液培养→单层细胞（原代细胞）
原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细 胞）
对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。50～70代） 仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制 备的首选细胞株。
传代细胞株 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体 细胞，能在体外无限增殖。增殖快，不易衰老， 易于传代保存。常用于病毒的分离鉴定，但不 能用于制备疫苗。
3.无菌送检
• •
二、病毒的形态学检查
1. 光学显微镜检查
主要观察病变组织中的包涵体，某些大病毒也通 过光学显微镜观察。 简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后 不形成包涵体
狂犬病毒胞浆内包涵体 （内基小体）
巨细胞病毒胞核内包涵体
（猫头鹰眼）
2. 电镜及免疫电镜检查 直接检查标本中的病毒颗粒，快 速，可确诊。但敏感性低（＞ 106/ml） 免疫电镜敏感性高，但只能用于 已知病毒的检测）
1. 组织培养
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外 人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。
组织培养的类型:
（1）组织块培养 （2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒； 人胚肠－ 肠道病毒 （3）细胞培养 最常用 原代和次代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞培养
原代和次代培养细胞
生殖道HSV-2涂片 DFA染色阳性
六、病毒的分子生物学检测
分子生物学方法可检测以不同形式存在的病毒 基因片断。 方法敏感、特异、简便、快速。
核酸电泳技术 核酸杂交技术 PCR
基因芯片技术
乙型肝炎病毒电镜图
轮状病毒电镜图
三、病毒的分离与鉴定
标本采集 标本处理后接种
动物接种 观察发病
组织培养
CPE EM
包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验
鸡胚接种
卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜 观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验
抗原检测 抗体检测 病理检查
（一）病毒的分离
组织培养 鸡胚培养 动物接种
根据抗体的效价对待测病毒液进行半定量检测。
中和试验的必要条件：
1. 活病毒 2. 敏感细胞、鸡胚或动物
中和试验的特点：
特异、敏感，既可检测抗体，也可测定抗原 （定属、定型）。
既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种， 以细胞培养法最常用。 检测IgG，不能用于早期诊断，常用于流行病学 调查。
（二）补体结合试验
含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物 或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应 的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于病 毒的分型。
五、病毒抗原检查
DFA、IFA、IEA等。 可检测细胞内、外的游离病毒抗原。 敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性 疾病的早期快速诊断。
Influenzavirus A培养 物DFA染色阳性
标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类 型选择标本种类 无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理
• •
抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素
抑制真菌生长 2.5μ g/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素
血清学检查标本：双份血清
（二）标本的运送与保存
1.低温送检
鼻Ｖ. 无CPE Poli.V
有CPE
鼻V.＋Poli.V 无CPE
4. 红细胞吸附及吸附抑制试验
受感染的宿主细胞膜含 病毒抗原（血凝素）， 可吸附鸡、豚鼠或猴红 细胞。 如果在培养瓶中加入 相应的血凝素抗血清， 则不出现红细胞吸附现 象，即红细胞吸附抑制 试验阳性
病毒的理化性质测定
主要用于新病毒的鉴定
优点
细胞来源广、敏感细胞株多 不受机体免疫因素的影响，个体差异小 病变结果易于观察 可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原 缺点 条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室 才能做
2. 鸡胚培养
卵黄囊接种（流行性脑炎病毒） 新鲜受精卵
38～39℃ 7～13d
接种病毒
羊膜腔接种（流感病毒）
四、病毒的血清学诊断
用已知病毒抗原检测患者血清中的相应抗体，可协助 诊断病毒感染。
双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义 单份血清IgM测定 可用于早期诊断，但部分病人可
能阴性，少数病人产生的特异性IgM抗体也可 在体内持续存在1～2年。
病毒血清学试验常用方法
（一）中和试验
原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去 感染性。 V.＋Ab → 失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒
优点 方法简单、结果易于观察 选择适当的接种途径，可出现类似人类的感染 症状，有利于发病机制的研究 缺点 可自然带毒或隐性感染，干扰实验结果 有个体差异 很多病毒无敏感动物，或感染后不出现明显症 状
（二）病毒的鉴定
病毒的初步鉴定 动物感染：敏感动物范围、潜伏期及发病情况 鸡胚接种：病毒对鸡胚的敏感性、特殊病灶 （如痘疱等） 细胞培养：病毒在细胞培养中的表现 理化性质的测定：主要用于新病毒的鉴定 病毒的最后鉴定 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝 抑制试验等。 分离的新病毒，必须进行系统的全面鉴定
细胞变圆、融合、肿胀、细胞空 泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱 性包涵体等。 某些病毒感染细胞后不出现CPE
3. 干扰现象（interference）
当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时， 其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为 病毒的干扰现象。 干扰现象也可被相应特异性抗体抑制，称为干 扰抑制现象
尿囊腔接种（传代培养） 绒毛尿囊膜接种（痘类病毒）
绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤
优点 鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径 病毒增殖快，可收获大量病毒 鸡胚本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗 体 缺点
易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺 炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。 某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降
病毒感染的实验诊断
王 跃 临床微免教研室
什么是病毒？
病毒（virus）是一类体积微小、结构简单、 有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。
特点：
体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器
无完整的细胞结构：蛋白质衣壳＋核酸核心 只有一种类型核酸：RNA或DNA 有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长 以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖