化学毒物的一般毒性作用第六章

化学毒物的一般毒性作用公共卫生与热带医学学院毒理学系卫秦芝2012-5-102急性毒性试验重复剂量毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验外源化学物基础毒性特殊毒性生殖毒性致突变致癌急性毒性重复剂量毒性亚慢性毒性慢性毒性生殖毒性试验致突变试验致癌试验机体研究化学毒物一般毒性作用的毒理学意义z毒理学工作中非常重要的内容；z安全性评价和危险度评定的基础；z对防治化学毒物中毒、制订标准以及管理毒理学等有重要意义。

2012-5-103第一节急性毒性作用2012-5-104一、概述（一）急性毒性的概念z急性毒性(acute toxicity)：是指机体(人或实验动物)一次接触或24小时内多次接触一定剂量外源化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒作用及其死亡。

2012-5-105一、概述（一）急性毒性试验的目的z测定毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，以LD50为主，进行毒性分级。

其他LD100，LD0，LD01。

z通过观察动物中毒表现，毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。

z为试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量设计及观察指标选择依据。

z提供毒理学机制研究的初步线索。

2012-5-106二急性毒性试验方法的要点z外源化学物种类的不同，急性毒性试验的程序和要求有所不同。

但总体原则和要点是相似的。

z常用的急性毒性试验染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。

2012-5-107二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验动物选择动物准备z急性毒性反应与人近似z易于饲养、操作方便z繁殖力较强，数量较大z价格较低，易于获得z给药前检疫观察，大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2-3周z适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响z筛检健康状况不符合试验要求的动物2012-5-108二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验动物种属和品系¾啮齿类：小鼠，大鼠（首选）小鼠：昆明种、NIH、ICR大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar¾非啮齿类：犬或猴2012-5-1092012-5-1010二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验动物大小用体重表示大鼠180～240g小鼠18～25g、家兔2～2.5kg豚鼠200~250g、Beagle犬4~6kg杂种犬8～15kg体重变异不应超过平均体重的20％2012-5-1011二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验动物性别：雌雄兼用，各组同一性别的动物数相等，雌性动物应为未孕和未产过仔的动物数量：每个剂量组每种性别≥5只动物动物分组：至少三个剂量组，组距适当2012-5-1012二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验毒效应的观察中毒症状、体重变化、病理检查及其它指标、死亡和死亡时间观察期限一般为14天，根据具体清况可适当延长观察终点死亡2012-5-1013二急性毒性试验方法的要点（一）经典的急性毒性试验LD50的计算z改进寇氏法：国内常用z概率单位图解法：z Bliss法：z霍恩（Horn）法：方法简单，但是精确度差z等2012-5-1014二急性毒性试验方法的要点（二）急性毒性替代试验1. 固定剂量法（fixed dose procedure）不以动物死亡作为观察终点利用固定的系列剂量染毒剂量范围是5、50、500mg/kg，最高限量是2000mg/kg。

高毒有毒有害不分级EEC急性经口毒性分级标准LD50 ＜25 mg/kg25 ~ 200 mg/kg200 ~ 2000 mg/kg＞2000 mg/kg2012-5-1015二急性毒性试验方法的要点（二）急性毒性替代试验2. 急性毒性分级法（acute toxic class method）实验设计结果判断z啮齿类，首选大鼠z从25、200、2000mg/kg 3个固定剂量中选择一个剂量开始进行试验，z每阶段3只动物，平均经2~4阶段即可z死亡为终点，观察14天①不需要进一步试验进行分级；②下一阶段以相同剂量的另一种性别试验；③下一阶段以较高或较低的剂量水平进行（从200mg/kg体重开始）。

2012-5-1016二急性毒性试验方法的要点（二）急性毒性替代试验3. 上-下移动法（up/down method）或阶梯法观察终点：死亡或其他毒效应实验方法：根据资料确定第一只动物的剂量，第1只动物染毒后的反应决定第2只动物接受化学物的剂量，剂量应在平均致死剂量左右。

动物数量：需要单性6-9只动物，比其他方法少。

2012-5-1017二急性毒性试验方法的要点（三）毒性作用观察¾中毒症状：什么样中毒症状、发生的时间、症状发展的经过、死亡前的特征以及死亡时间等；¾体重：可以反映动物中毒后的整体变化；¾病理检查及其它指标：对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查。

对存活动物：在观察期结束时进行大体病理检查；¾死亡和死亡时间：分析中毒死亡时间的分布规律；意义：弥补LD50在描述急性毒性作用上的不足为亚慢性和慢性毒性试验提供观察指标2012-5-1018二急性毒性试验方法的要点（三）毒性作用观察¾毒作用规律：兴奋→抑制→死亡抑制→死亡¾毒性快慢：速发；迟发¾毒性表现：因化学物的毒性机制不同而异¾可逆性：注意非致死性效应的可逆性2012-5-10192012-5-1020续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现2012-5-1021三、LD50应用中的有关问题LD50具有很重要的毒理学意义①LD50标准化毒物毒作用强度，评价和比较毒物对机体毒性的大小。

②计算药物的治疗指数，药效剂量和毒性剂量的距离。

③为后续的重复给药毒理学试验剂量的选择提供参考。

④通过比较不同途径的LD50值，获得生物利用度的信息。

⑤试验结果可用来推测人类的致死剂量以及中毒后的体征，为临床毒副反应提供监测参考。

2012-5-1022三、LD50应用中的有关问题LD50的局限性¾评价新药或化学物时，LD50值给予有效的信息较少，实用性有限¾LD50的波动性很大，影响因素多¾LD50受物种差异影响大¾消耗动物数量大：经典急性毒性试验一次实验至少需要30至50只动物。

较替代试验多1/32012-5-10232012-5-1024四、急性毒性分级和评价急性毒性试验主要目的之一《全球化学品统一分类和标签制度（GHS ）》表6-2 急性毒性危害类别和急性毒性估计值（LD 50/LC 50值）51.00.50.05粉尘与烟雾（mg/l ）20102.00.5蒸气（mg/l ）50002500500100气体（ppmV ）200010020050经皮（mg/kg 体重）50002000300505经口（mg/kg 体重）第5类第4类第3类第2类第1类接触途径2012-5-1025急性毒性作用四急性毒性分级和评价2012-5-1026第二节局部刺激试验z了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性和腐蚀性z包括眼刺激、皮肤刺激试验z为制定化学物对眼睛和皮肤保护措施提供依据z我国农药、化学品和消毒剂毒理学试验程序均规定局部刺激试验为必做项目。

2012-5-10272012-5-1028一、眼刺激试验不可逆性组织损伤眼原发性刺激试验（eye primary irritation test ）眼刺激性（eye irritation ）眼腐蚀性（eye corrosion ）可逆性炎症变化观察终点一、眼刺激试验z强酸及强碱性物质可免除眼刺激试验z产生皮肤刺激的物质不一定有眼刺激体征（PH接近中性）家兔4只观察：结膜（发红、球结膜水肿和分泌物）Draize试验角膜（混浊程度和范围）虹膜（充血、肿胀和角膜周围充血）观察期：7天，必要时延长至21天判断：分级标准进行评分，主观判断2012-5-10292012-5-1030二、皮肤原发性刺激试验局部不可逆性组织损伤皮肤原发性刺激试验（sikn primary irritation test ）皮肤刺激性（dermal irritation ）皮肤腐蚀性（dermal corrosion ）局部可逆性的炎症变化单次和多次皮肤刺激试验完整皮肤和破损皮肤刺激试验二、皮肤原发性刺激试验3种情况下，不适宜做皮肤刺激试验。

①可能有腐蚀性的物质（如pH≤2或pH＞11.5）；②在急性经皮毒性试验显示有很强系统毒性的物质；③在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kg时仍无皮肤刺激体征的物质。

2012-5-1031二、皮肤原发性刺激试验皮肤刺激评价方法Draize试验¾常用的动物是家兔及豚鼠¾皮肤反应的表现为红斑、紫红色斑，焦痂，¾按红斑和水肿的严重程度评分。

¾观察时间：应观察到可逆或不可逆刺激作用，一般不超过14天。

破损皮肤刺激试验：伤口消毒用的产品2012-5-1032二、皮肤原发性刺激试验影响皮肤刺激反应的因素①皮肤的完整性，破损吸收强②固态受试物的物理特性，缘锋利、较硬的纤维状③固体于干燥比溶解状态刺激性弱④人受损伤的皮肤应作处理后在进行试验⑤受试物在动物皮肤表面封闭染毒的严密程度⑥实验动物的年龄与性别不同以及受试部位的影响⑦个人主观判断的差别⑧动物物种不同会造成皮肤反应的差异，敏感顺序为兔＞豚鼠＞人＞猪2012-5-1033二、皮肤原发性刺激试验眼刺激试验和皮肤刺激试验替代方法鸡胚绒毛膜尿囊膜试验（HET-CAM）绒毛膜尿囊膜苔盼篮染色试验（CAM-TBS）和荧光素漏出试验（FLT）试验2012-5-10342012-5-1035三、皮肤致敏试验迟发性超敏反应（接触性皮炎）一次接触较轻的反应或无明显反应再次接触几周，甚至几年外源性化学物质可能的机制：半抗原完全抗原诱导抗体形成皮肤超敏反应产生免疫记忆2012-5-1036三、皮肤致敏试验动物对致敏性物质的敏感性高两类皮肤致敏的试验福氏完全佐剂（FCA）的方法不加佐剂的方法动物：豚鼠接触：诱导接触和激发接触间隔10 ～14 天诱导接触：较低或中等浓度，重复染毒，涂皮或皮下注射，14天激发接触：激发剂量（低于诱导时的剂量）未染过毒的皮肤部位观察时间：24小时、48小时和72小时结果评定：根据诱导导及激发后的水肿、红斑出现的情况评分试验设计第三节短期、亚慢性和慢性毒性作用2012-5-1037一、概述z人类实际接触化学物方式是长期的，重复的，低水平z接触方式不同，毒性不同，急性毒性难以预测慢性毒性z研究长期低剂量重复接触毒性很重要重复剂量毒性作用（短期）亚慢性毒性作用慢性毒性作用重复剂量毒性试验（短期毒性试验）亚慢性毒性试验慢性毒性试验2012-5-10382012-5-1039一、概述(一) 蓄积作用蓄积作用（accumulation ）：外源化学物连续地、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在体内逐渐增加并贮留。