DNA提取原理和方法 ppt课件
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《分子生物实验技术》PPT课件
（3）苯抽提法
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯 酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子 表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于 酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复 操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃 漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天 然状态 。
10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中
9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化 合物
10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到
SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再 将剩余的混合物加入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新 的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50~100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合 物湿润，55℃温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用
power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20℃保存备用
Fast-Prep SPIN Kit（for soil） 操作说明
DNA和质粒抽提PPT课件
第43页/共142页
二、DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋
外敷PEG至合适量
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此 重复几次可显著减少DNA体积
第44页/共142页
三、DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
第24页/共142页
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降 解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在 RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
第25页/共142页
第26页/共142页
5、核酸的贮存——DNA保存
1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少 DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。
• 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因
第58页/共142页
第59页/共142页
质 粒 DNA 制 备
plasmid extraction
第60页/共142页
质粒简介
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子
其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行
第37页/共142页
DNA的沉淀
1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子 表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。
无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释 放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分 子
二、DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋
外敷PEG至合适量
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此 重复几次可显著减少DNA体积
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三、DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
第24页/共142页
完整性鉴定
凝胶电泳法：
基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降 解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在 RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
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5、核酸的贮存——DNA保存
1）短期贮存： 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少 DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。
• 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因
第58页/共142页
第59页/共142页
质 粒 DNA 制 备
plasmid extraction
第60页/共142页
质粒简介
质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子
其大小范围从lkb至200kb以上不等。 已经在形形色色的细菌类群中发现质粒. 这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行
第37页/共142页
DNA的沉淀
1）无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子 表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。
无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释 放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分 子
课件：实验八 动物组织中DNA的提取
分离到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷 基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，让DNA 游离出来，再用氯仿-异戊醇混和试剂沉 淀除去变性的蛋白质。然后加入95%乙 醇，可将DNA沉淀析出。
为了防止DNA酶解，在提取过程中加柠檬 酸盐、EDTA盐并要求在40C以下进行，以抑 制DNA酶的活性。
三、实验试剂及器材
1. 称取动物肝脏10g，剪碎后加入预冷的 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸 钠溶液10ml，在组织捣碎机中捣成匀浆。
2. 4℃，6000rpm,离心15min，弃上清。
3. 沉淀中加入2倍体积的冷0.15mol/LNaCl0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液，搅匀， 4℃， 6000rpm,离心15min，弃上清。
1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L,pH7.0柠檬酸钠溶液 2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/L, EDTANa2溶液 3. 5%SDS溶液 4. 氯仿-异戊醇溶液：氯仿：异戊醇=24：1 5. 95%乙醇 6. 固体氯化钠 6. 组织捣碎机 7. 冷冻离心机
四、实验操作
动物生物化学实验
实验八 动物组织中DNA的提取
一、实验目的
• 1.学习从动物组织细胞中提取DNA的基本原理。 • 2. 掌握提白质结合成
脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白而存在。这两
种核蛋白在不同浓度的盐溶液中，有不同的 溶解度。在稀盐溶液（0.15mol/L）中，核糖 核蛋白溶解度大，脱氧核糖核蛋白溶解度小； 而在高盐溶液中（ 1mol/L）中，脱氧核糖核 蛋白溶解度大，核糖核蛋白溶解度小。利用 此差异，可见两种核蛋白彼此分开。
7. 将此溶液约4ml倒入离心管中，加入等体积的
氯仿-异戊醇，剧烈振荡10分钟，离心5分钟，可 见离心液分为三层：上层为清液，中层变性蛋白， 下层氯仿-异戊醇。
植物DNA的提取ppt课件
在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱 性溶液中较稳定。
由于生物材料的差异，不可能有一种普 遍适用的提纯生物体DNA的方法，植物材 料有坚固的细胞壁，核酸含量较少，含有 较多的多糖物质和色素、核酸酶活性高等 这些因素给植物DNA的分离纯化带来了困 难。
DNA提取
十二烷基硫酸钠
SDS法 SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的
去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶 电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及 裂解核酸-蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质 与DNA的结合，使DNA释放出来。SDS是有效的阴 离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引 力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。
CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：
3、加入等体积的 Tris 饱和酚-氯仿-异戊醇（ 25：24：1），在摇床上充分摇动15min； 10000rpm 离心10min，取上清 700μl。 4、加入 1/10 上清液体积的 Rnase，混匀； 37℃水浴 40min-1h。 5、加入等体积的的氯仿-异戊醇（24：1）， 摇床上摇动 15min；10000rpm 离心10min， 取上清约 500μl。
注意事项
1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的 材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；
2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较 多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％）， 尽可能选取幼嫩的材料；
3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要 离心过度，否则沉淀再溶解难；
4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在 分离制备过程中必须采用温和的条件，避免 过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时 还要避免核酸降解酶类的降解。
6. 加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙 醇，充分混匀，4℃冰箱中静置20min。
由于生物材料的差异，不可能有一种普 遍适用的提纯生物体DNA的方法，植物材 料有坚固的细胞壁，核酸含量较少，含有 较多的多糖物质和色素、核酸酶活性高等 这些因素给植物DNA的分离纯化带来了困 难。
DNA提取
十二烷基硫酸钠
SDS法 SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的
去污剂。它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶 电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及 裂解核酸-蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质 与DNA的结合，使DNA释放出来。SDS是有效的阴 离子去垢剂，细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引 力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。
CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：
3、加入等体积的 Tris 饱和酚-氯仿-异戊醇（ 25：24：1），在摇床上充分摇动15min； 10000rpm 离心10min，取上清 700μl。 4、加入 1/10 上清液体积的 Rnase，混匀； 37℃水浴 40min-1h。 5、加入等体积的的氯仿-异戊醇（24：1）， 摇床上摇动 15min；10000rpm 离心10min， 取上清约 500μl。
注意事项
1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的 材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；
2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较 多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％）， 尽可能选取幼嫩的材料；
3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要 离心过度，否则沉淀再溶解难；
4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在 分离制备过程中必须采用温和的条件，避免 过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时 还要避免核酸降解酶类的降解。
6. 加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙 醇，充分混匀，4℃冰箱中静置20min。
细胞外周血DNA提取ppt课件
8、限制性内切酶酶切：
下述各试剂加入Eppendorf管内：
人类基因组DNA
0.1-1 ug
10×酶解缓冲液
2 ul
EcoR I （10u/uL）
1 ul
加双蒸水至 20ul (建议先算好体积，最先加)
a、涡旋混匀，短暂离心。
b、置恒温水浴箱内，按EcoR I限制酶的活性温度要求，37℃ 酶解过夜
C、置于4℃或-20℃保存。
10
步骤
1．取外周抗凝血（全血）200ul 于Eppendorf管中， 12000rpm离心12min。
2. 弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。混匀后 加6M NaI溶液200ul，充分摇匀20s。
3. 加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇 匀20s，12000rpm离心12min。
11
步骤
4. 取上层液350 ul，加入另一新Eppendorf管中，加 210 ul异丙醇，重新摇匀20s，室温放置15min， 静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀 紧贴Eppendorf管壁。
5. 弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动，可轻轻颠倒 混匀），以15000rpm离心12min。
5
PCR反应反复进行三步骤的循环过程： 热变性——退火——引物延伸 1）热变性：基因组DNA在95 ℃下加热5分，双螺旋结构被热变
性解链为两股单链。 2）退火：将反应混合物降温至55~65℃，引物与上述单链DNA
上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合。 3）引物延伸：将反应混合物调节至72℃，在DNA聚合酶作用下，
实验三、外周血细胞基因组 DNA的提取 (NaI法)
1
基因组DNA提取原理
人教版高中生物选修一全册ppt课件dna的粗提取与鉴定
(6)在 DNA 的析出与鉴定中,必须使用冷酒精(至少在 5 ℃以下存放 24 h),并且将一份含 DNA 的氯化钠溶液加入到两份冷酒精中,如果悬浮 在溶液中的 DNA 丝状物较少,可将混合液放入冰箱中再冷冻几分钟。
2.实验现象不明显的原因分析 (1)材料中核物质没有充分释放出来,如研磨不充分或蒸馏水的量 不够。 (2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛,DNA 被破坏。 (3)二苯胺配制时间过长,变成浅蓝色,影响鉴定效果。 (4)析出含 DNA 的黏稠物时,蒸馏水一次快速加入,影响实验结果。 (5)实验中有多次搅拌,但是其目的及操作方法是不同的,操作时不 注意区分,影响实验结果。
(4)实验中有两次使用蒸馏水。第一次加水是在获取 DNA 滤液时, 是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充分搅拌,应不少于 5 min,使 血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是在去除滤液中杂质时,加水是为了 稀释氯化钠溶液,使 DNA 逐渐析出。
(5)实验中有三次加氯化钠溶液。第一次是在破碎植物细胞获取 DNA 滤液时,加入氯化钠溶液是为了提高 DNA 的溶解度。第二次和第 三次都是在去除滤液中的杂质的步骤中。第二次加入氯化钠溶液,是为 了调节氯化钠溶液物质的量浓度为 2 mol/L,过滤除去不溶的杂质。第三 次加入氯化钠溶液是为了将析出的 DNA 丝状物溶解。
DNA 不被蛋白酶水 解
DNA 不溶于酒精溶 液
DNA 可被二苯胺试 剂染成蓝色
加入嫩肉粉
加入冷却酒 精(体积分数 为 95%) 加入二苯胺 试剂并沸水 浴
嫩肉粉中含木瓜蛋白酶,水解蛋白质 DNA 析出,除去溶于酒精的蛋白质 鉴定 DNA
2.DNA 和蛋白质在不同的物质的量浓度的 NaCl 溶液中的溶解度
预习交流
——如何观察 DNA 和 RNA 在细胞中的分布? (1)你能总结一下 DNA、RNA 在细胞中的分布规律吗? 提示:对真核生物而言,DNA 主要存在于细胞核(染色质)中,线粒体、 叶绿体中也有少量的 DNA。RNA 主要存在于细胞质(细胞质基质、核 糖体、叶绿体、线粒体)中,细胞核中也有少量的 RNA。 (2)你能列举不能用来提取 DNA 的细胞吗?请给出必要的解释。 提示:哺乳动物成熟的红细胞、植物的筛管细胞等,因为它们失去了 细胞核,而 DNA 分子主要存在于细胞核中。 (3)观察 DNA、RNA 在细胞中分布实验的原理是什么? 提示:用吡罗红甲基绿的混合染色剂对细胞染色,然后用显微镜观 察。绿色区域代表 DNA 的分布区域,红色区域代表 RNA 的分布区域。
2.实验现象不明显的原因分析 (1)材料中核物质没有充分释放出来,如研磨不充分或蒸馏水的量 不够。 (2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛,DNA 被破坏。 (3)二苯胺配制时间过长,变成浅蓝色,影响鉴定效果。 (4)析出含 DNA 的黏稠物时,蒸馏水一次快速加入,影响实验结果。 (5)实验中有多次搅拌,但是其目的及操作方法是不同的,操作时不 注意区分,影响实验结果。
(4)实验中有两次使用蒸馏水。第一次加水是在获取 DNA 滤液时, 是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充分搅拌,应不少于 5 min,使 血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是在去除滤液中杂质时,加水是为了 稀释氯化钠溶液,使 DNA 逐渐析出。
(5)实验中有三次加氯化钠溶液。第一次是在破碎植物细胞获取 DNA 滤液时,加入氯化钠溶液是为了提高 DNA 的溶解度。第二次和第 三次都是在去除滤液中的杂质的步骤中。第二次加入氯化钠溶液,是为 了调节氯化钠溶液物质的量浓度为 2 mol/L,过滤除去不溶的杂质。第三 次加入氯化钠溶液是为了将析出的 DNA 丝状物溶解。
DNA 不被蛋白酶水 解
DNA 不溶于酒精溶 液
DNA 可被二苯胺试 剂染成蓝色
加入嫩肉粉
加入冷却酒 精(体积分数 为 95%) 加入二苯胺 试剂并沸水 浴
嫩肉粉中含木瓜蛋白酶,水解蛋白质 DNA 析出,除去溶于酒精的蛋白质 鉴定 DNA
2.DNA 和蛋白质在不同的物质的量浓度的 NaCl 溶液中的溶解度
预习交流
——如何观察 DNA 和 RNA 在细胞中的分布? (1)你能总结一下 DNA、RNA 在细胞中的分布规律吗? 提示:对真核生物而言,DNA 主要存在于细胞核(染色质)中,线粒体、 叶绿体中也有少量的 DNA。RNA 主要存在于细胞质(细胞质基质、核 糖体、叶绿体、线粒体)中,细胞核中也有少量的 RNA。 (2)你能列举不能用来提取 DNA 的细胞吗?请给出必要的解释。 提示:哺乳动物成熟的红细胞、植物的筛管细胞等,因为它们失去了 细胞核,而 DNA 分子主要存在于细胞核中。 (3)观察 DNA、RNA 在细胞中分布实验的原理是什么? 提示:用吡罗红甲基绿的混合染色剂对细胞染色,然后用显微镜观 察。绿色区域代表 DNA 的分布区域,红色区域代表 RNA 的分布区域。
实验一 质粒DNA的提取(共25张PPT)
这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉 淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇
沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
结构的三大要素： • 多克隆位点
• 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位
种类：
• 质粒
• 噬菌体
• 酵母人工染色体（YAC）
• 反转录病毒载体 • 表达载体等
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法；
掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， ）； （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是 质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质 形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，
沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
结构的三大要素： • 多克隆位点
• 选择标记（耐药性，LacZ） • 独立的复制单位
种类：
• 质粒
• 噬菌体
• 酵母人工染色体（YAC）
• 反转录病毒载体 • 表达载体等
pET-32a Vector
The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant
实验目的
了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法；
掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。
实验原理
质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复 制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小 型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室 常用的方法。
这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与 线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离 它们。
在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
2. 溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L ）；Tris·HCl（ 25mmol/L， ）； （10mmol/L） 3. 溶液Ⅱ： NaOH （） ；SDS （ 1%，新鲜配制） 4. 溶液Ⅲ： 60ml的 5mol/L KAC ； 的冰醋酸 ； 28.5ml H2O
溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。但是 质粒DNA与染色体DNA复性的速度不同。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质 形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，
实验九动物组织中DNA的提取与鉴定PPT课件
DNA鉴定
琼脂糖凝胶电泳
将提取的DNA进行琼脂糖 凝胶电泳，观察电泳结果， 判断DNA的纯度和浓度。
紫外吸收法
利用紫外分光光度计测量 DNA溶液在260nm处的吸 光度值，计算DNA的浓度 和纯度。
荧光染料染色法
利用荧光染料染色DNA， 通过荧光分光光度计测量 DNA的荧光强度，判断 DNA的纯度和浓度。
细胞内的DNA。
DNA提取
离心
将匀浆后的样品进行离心，使细胞碎片和 杂质沉淀到底部，上清液中含有DNA。
洗涤
用洗涤液清洗吸附柱，去除未被吸附的杂 质。
吸附
将上清液加入到吸附柱上，DNA被吸附在 吸附柱的硅基质膜上，而蛋白质和其他杂 质被排除。
洗脱
用洗脱液将DNA从吸附柱上洗脱下来，收 集洗脱液中的DNA。
移液器
用于精确移取和量 取实验试剂。
电脑和PPT软件
用于制作和展示实 验课件。
03
实验步骤
样品处理
样品收集
选择新鲜的动物组织样品，确保 无菌条件下收集，避免样品受到
污染。
样品处理
将收集的动物组织切成小块，用 生理盐水或磷酸盐缓冲液冲洗，
去除表面的污物和血液。
样品匀浆
将处理过的组织块放入匀浆器中， 加入适量的匀浆介质（如石英砂、 玻璃珠等），破碎细胞，释放出
电泳技术的局限性
琼脂糖凝胶电泳技术虽然能够较好地分离DNA条带，但对于较长片段和大分子量DNA的 分辨率有限，未来可考虑采用其他电泳技术或优化现有技术。
纯度分析的注意事项
在紫外分光光度计检测过程中，需要注意消除样品中蛋白质、酚类等物质的干扰，以确保 纯度分析的准确性。同时，对于不同来源和性质的DNA样品，可能需要采用不同的纯度 分析方法。
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overnight or until tissue is dissolved;
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;
Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;
2
DNA提取原理和方法
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
3
DNA提取原理和方法
提取DNA总的原则 :
组织、6培养细胞
细DN菌A提、取酵原理母和方法
基因组DNA的提取
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆 细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
酒精沉淀
9
DNA溶液
DNA提取原理和方法
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
12
DNA提取原理和方法
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
DNA extraction
ZJL
12014.05.09
DNA提取原理和方法
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
• 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。
• 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
10
DNA提取原理和方法
共价闭合环状结构
5
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有：
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母
物，从而达到分离目的。 7
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物8
DNA提取原理和方法
基因组DNA－SDS法
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
11
DNA提取原理和方法
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
4
DNA提取原理和方法
DNA提取的几种方法
基因组D粒DNA的提取
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;
Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;
2
DNA提取原理和方法
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
3
DNA提取原理和方法
提取DNA总的原则 :
组织、6培养细胞
细DN菌A提、取酵原理母和方法
基因组DNA的提取
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆 细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
酒精沉淀
9
DNA溶液
DNA提取原理和方法
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
12
DNA提取原理和方法
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
DNA extraction
ZJL
12014.05.09
DNA提取原理和方法
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
• 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。
• 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
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DNA提取原理和方法
共价闭合环状结构
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DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有：
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母
物，从而达到分离目的。 7
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物8
DNA提取原理和方法
基因组DNA－SDS法
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
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DNA提取原理和方法
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
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DNA提取原理和方法
DNA提取的几种方法
基因组D粒DNA的提取