IEF电泳分离
电泳分离技术
电泳分离技术
（二）缺点 1.易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染
色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
电泳分离技术
蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量 随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH 溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白 分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再 移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构 成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白 分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位 置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等 电点。
电泳分离技术
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
电泳分离技术
由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因 而逐渐发展起了区带电泳。 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质 的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力， 不便于推广应用。 区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相 介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。 凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越 来越广泛的应用。
无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。 6. 无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。
电泳分离技术
电泳分离技术
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最 常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点等电点(isoelectri。
point)是蛋白质的最重要理化性质之一，其定义是当蛋白质的酸性解离与碱性解离趋势相等，蛋白质分子的净电荷为零时，环境的pH。
当蛋白质分子的pI<环境pH时带正电荷向负极移动，pI>环境pH时带负电荷，向正极移动，处于等电点时的蛋白质在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动。
每一种蛋白质都有一个特定的等电点，测定蛋白质的等电点最为普遍采用的方法是等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)电泳，IEF是60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，其分辨率高，可达0．001pH单位，且操作方便、迅速，因此除用于蛋白质等电点测定外，也常被用于蛋白质纯度鉴定及分离制备蛋白质，是生物化学、分子生物学、遗传学等研究中的重要分离、分析方法。
实验原理等电点聚焦电泳的基本原理是通过在凝胶中加入载体两性电解质，使其在电场作用下，从阳极到阴极形成一个连续而稳定的线性pH梯度，其正极为酸性，负极为碱性，通常使用的载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸化合物，其在电泳中形成的pH梯度范围有3～10，4～6，5～7，8～10等，蛋白质在IEF电泳时，当样品置于负极端时，因pH>pI，蛋白质分子带负电荷，电泳时向正极移动，在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷逐渐减少，蛋白质分子移动的速度逐渐变慢，当移动到pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动而聚焦成带。
当蛋白质置于正极时，也会获得同样的结果。
因此在进行IEF电泳时，样品可以置于任何位置。
由于各种不同蛋白质的氨基酸组成不同，因而有不同的等电点，在IEF电泳时，会分别聚焦于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带。
在IEF电泳中蛋白质区带的位置是由电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小及形状无关。
因此根据蛋白质区带在pH梯度中的位置便可测得该蛋白质的等电点。
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析汇总
等电聚焦技术
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又 分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。 前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部 分。
三、载体两性电解质 1. 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质 的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯 多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它 是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物 组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。
Байду номын сангаас
提高疏水蛋白在水中的溶解性
1. 尿素
改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加
多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。
尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性 的最好方法。
7.加样方法
根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置都可 得到相同的结果。
2. 引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带
有最低等电点的分子（带最多的负电荷）将最快
的向阳极迁移，当它达到净电荷是零的位置时才
停止。
其次是一些低pI的载体两性电解质分子 （带有其次多的负电荷）也将向阳极移动， 直到它的净电荷被减少到零即停止。
3. 电泳结束后的变化
所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办
第三节 等电聚焦
(isoelectric focusing，IEF)
一、概述 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60 年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析 技术。它是利用具有pH梯度的支持介质分离 等电点不同的蛋白质的电泳技术。
电泳分离概述
29
1、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳一方面根据蛋白质电荷密度，也就 是在缓冲液中不同蛋白质间同性静电荷的差异，另一方面 基于分子筛效应，即与分子大小和形状有关，因此用聚丙 烯酰胺凝胶电泳不仅能分离各种蛋白质分子的混合物，还 可以研究其特性，如电荷、分子量、等电点乃至构想，并 且可以用于蛋白质纯度的鉴定。
13
5）电渗作用
电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为电渗。 固体支撑物多孔且带有可解离的带电基团，解离后常吸附溶液 中带正电或负电的反离子，这些反离子不是固定的，随着电压 梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。总体效 果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。 电渗影响带电质点的迁移速度。但在保持一定的电渗流是有益 的，比如免疫电流。
垂直平板电泳：上下两个电泳槽，中间经垂直平板相连 ，凝胶加在两块垂直平行玻璃或塑料板之间。
26
一般平板电泳：凝胶载体为惰性材料，只起支撑作用， 无分离作用，如淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等 。
特殊平板电泳：载体除支持作用外，主要起分离作用， 如等电聚焦电泳、pH梯度电泳、密度梯度电泳、亲和电泳 等
6、
23
2、 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：
①纸电泳。
②色谱电泳
③醋酸纤维素薄膜电泳
④凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电 泳载体。
⑤聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和 电泳等。
聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持 介质。
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3、按电泳次数、方向
①一维电泳：仅一个方向电泳一次。 ②二维电泳：平面X轴、Y轴方向各电泳一次。
4
双向电泳的基本原理
双向电泳的基本原理
双向电泳是蛋白质组学研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
其基本原理是：样品中含有两种或两种以上不同分子量的蛋白质，它们的分子量分布不同，在加有等电聚焦（IEF）等电聚焦缓冲液的一台凝胶电泳仪（如UMEACO）上，蛋白质分子按其大小和分子量进行分离，并可在不同的pH 范围内进行电泳。
由于等电聚焦缓冲液具有强的选择性，不同分子量的蛋白质在同一胶上得到分离，经凝胶染色后在垂直于凝胶的方向上能显示出清晰的条带。
蛋白质分子量大的向小的方向移动，分子量小的向大的方向移动。
每一条带就是一个独立的分子。
双向电泳技术可以大大缩短实验时间、降低实验成本、提高分析效率。
例如：已知蛋白序列为a/b/c，对某一蛋白进行研究，只需分离出a/b/c三条带，再经双向电泳技术分离后即可得到含有三条带的蛋白质条带。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中最重要的技术之一，其基本原理是：将样品制备成胶后，在垂直于凝胶电泳方向上将蛋白进行分离。
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3.5 等电聚焦电泳的缺点
先用pH3-10的宽范围的两性电解质粗测,再用如 pH6-8等窄范围的两性电解质细测
在pH3-10的范围内测定 无法测定小于pH3或大于pH10 蛋白聚焦靠近两性电解质的极端的pH范围,其pH 是测不准的
pH8.3 pH9.0 pH10.2 pH10.6
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圆盘状IEF测定乙醇酸氧化酶的pI
板状电泳
◆ 在板状凝胶的一个泳道加入样品；在另一泳
道加入多中已知pI的标准蛋白。通过比较标 准蛋白的pI，则可测定样品的pI。
◆
采用表面pH电极
注意:测定时温度与电泳聚焦时的温度一致。温度 对pH的测定有较大影响
1
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板状IEF测定乙醇酸氧化酶的pI
蛋白酶分离纯化技术
华南师范大学生命科学学院
2005/2006
3.4 等电聚焦(IEF)的分辨率
分辨率是能分辨出的相邻两条蛋白带的pI 的差值(⊿ pI)
◆ D: 蛋白扩散系数(常数) ◆ dpH/dx: pH梯度
◆ E: 电场强度
◆ du/dpH: 蛋白迁移率(常数)
目前最大分辨率为0.001pH
稳定,接近为零
※根据需要，将凝胶进行不同的处理 ♠测定纯度
进行酶的特异性染色(活性染色)和普通的蛋白染色 (考马斯亮蓝染色)
♥测定pH值
圆盘状电泳
★ 将凝胶从玻璃管中取出,等分成若干小段。各小 段分别用一定量的蒸馏水浸泡提取2-3h，然后测定 水溶液的pH值
★将凝胶从玻璃管中取出,采用表面pH电极直接测 定凝胶表面不同部位的pH值 注意:测定时温度与电泳聚焦时的温度一致。温度对 pH的测定有较大影响
图. 用醋酸纤维薄膜电泳测定乙醇酸氧化酶的pI 1,2,3,4: pH分别为8.3、9.0、10.2和10.6，箭头所指的 是酶蛋白点样的位置
4 等电聚焦电泳的种类
是否加入电泳支持物(或稳定剂)
加入支持物(或稳定剂)的种类
4.1 自由溶液IEF
不加入电泳支持物(或稳定剂)
方便分离蛋白 要迅速回收蛋白
5:标准蛋白; 1,6-7:乙醇酸氧化酶
♣ 若要在等电聚焦后，进一步制备其多克
隆抗体
ₒ把蛋白带子切下,研磨
ₒ离心取上清,加入佐剂(亲脂性分子),注射至动物体内 ₒ免疫五次后,取动物血
♦若要在等电聚焦后，进一步纯化
双向电泳 将凝胶条取出后，平放于SDS-凝胶平板的 表面，再进行SDS-PAGE电泳
毛细管电泳的电渗作用
2 分离模式 按毛细管内是否有无分离介质，以及分离 介质的种类来分
♠ 毛细管自由电泳 毛细管内无分离介质，一般毛细管电泳就是指毛细 管自由电泳
♠ 毛细管凝胶电泳 毛细管内加入聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，使蛋 白按大小进行分离
♠ 凝胶内加入SDS，蛋白也经SDS裂解后上样，
SDS-毛细管凝胶电泳
可同时可测定带负电、带正电和不带电的蛋白酶 的亚基分子量
A
苯甲酸
B
C
1 2 3
4
5
乙醇酸氧化酶的SDS-PAGE (A),CE-SDS (B)和SDS-醋酸 纤维素薄膜电泳(C)
1:乙醇酸氧化酶; 2:标准层的毛细管电泳
用不带电的物质凃在毛细管的内壁上，可消除电渗作用
除去两性电解质,蔗糖等分子量较小的物质
4.3聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(最常用)
用聚丙烯酰胺凝胶为支持物
圆盘状电泳或板状电泳
操作过程
※制备凝胶和蛋白上样. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合, 凝胶浓度为10％左右, 同时加入两性电解质
※ 待测蛋白可在制备凝胶前或后均可以
※等电聚焦: 从400V提高为800V左右。电流不断下降至
既按等电点，又按分子量的大小进行分离
分辨率更高
蛋白质组学的核心技术
七、 毛细管电泳 1 原理 采用石英毛细管，层析柱的内径很小(<75um)
在pH>3, 石英毛细管层析柱的内表面带负电, 使与之接触的溶液感应带正电
在高压下，电渗的作用大大增强。 在溶液无论带正电、负电和不带电的蛋白酶均 向负极泳动
4.2蔗糖或甘油密度梯度等电聚焦
两性电解质和蔗糖或甘油等稳定剂一起加入 操作过程
※等电聚焦: 从400V提高为800V左右。电流不断下降
至稳定,接近为零 ※ 用泵小心吸出聚焦柱外的正极和负极电极溶液,分 步收集。注意:不要震动柱子，以防止区带紊乱
※分别测定pH值、蛋白质含量或酶活力等 ※把酶活力高的几管合并,采用透析、凝胶层析等方法