第八章 电泳分离技术.
不连续凝胶电泳示意图
（三）聚丙烯酰胺胶体的制备
制胶模 1 梳形样品槽模板 2 长玻璃板（后面） 3 短玻璃板（前面） 4 U形橡胶框
（四）聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 • 1、电渗作用比较小 • 2、凝胶孔径可调 • 3、电泳分辨率高 • 4、化学稳定性和热稳定性好 • 5、机械强度高
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）按有无固体支持物分类
1、按有无固体支持物可以分为 两2、类支：持自物由电泳电根泳据和所支用持的支物持电物泳不。
同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜 电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺 凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙 烯酰胺凝胶电泳
第二节 常用电泳分离技术ห้องสมุดไป่ตู้
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）基本原理 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应 （1）连续性电泳系统的凝胶浓度一致，凝胶中的pH值
第八章 电泳分离技术
第一节 电泳的基本理论及分类
一、原理
（一）概念及原理 1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身
带相反电荷的电极移动的现象。
2、原理
电泳技术就是利用在电场作用下，由于 待分离样品中各种分子带点性质以及分子本 身大小、性状等性质的差异，使带电分子产 生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、 鉴定或提纯。
选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
样品 蛋白质（酶） 核酸（RNA）
分子量范围
<104 (1～4)×104 4×104～1×105 1×105～5×105
>5×105
<104 104～105 1×105～2×106
适宜的凝胶浓度 (T%)
20～30 15～20 10～15 5～10 2～5
15～20 5～10 2～3.6
第八章电泳
分离操作
不连续的凝胶层上部和下部分别使用pH值不同的缓冲 液。以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白 质的等电点选定。例如，如果蛋白质的等电点小于8－9.5 时，可采用pH8.3的甘氨酸-Tris－HCl缓冲液。浓缩层用 pH6.8的缓冲液平衡。此时，Cl－为前导离子，阴离子甘氨 酸为末尾离子，Tris为反离子，，料液中的蛋白质夹在前 导离子和末尾离子间在浓缩层内泳动，最后达到等速电泳 状态进入下层分离凝胶。在下层凝胶中，蛋白质受到高浓 度凝胶的分子筛作用，不能继续保持等速泳动，被末尾离 子甘氨酸超过，因而在分离区带前面显示甘氨酸区带的pH 值，蛋白质之间根据荷电量和分子大小，进行一般的凝胶 电泳，得到分离。
3.3 等电点聚焦
IEF的分离对象：蛋白质、两性分子 IEF操作的关键:是调配稳定的连续pH梯度， 一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸的缓冲 溶液调 配pH梯度，前者的生物相容性好，但 形成的pH梯度稳定性较差；后者的聚合物含有 许多正负电荷，且与蛋白质的等电点范围相同， 缓冲能力强，pH梯度较为稳定，称为载体两性 电解质。 应用：同工酶分离、分析、pI测定
3.2 不连续凝胶电泳
等速电泳的关键：使用含强酸和强碱基的前导 电介质以及含有弱酸和弱碱基的末端电解质从电泳 池的两侧流过，含料液的两性试样从电泳池中央流 过，调pH值，使前导离子 ＞样品＞末端离子，使 不同的溶质在电场力作用下达到分离。 用途：分析技术，目标蛋白与杂质的分离，两 种蛋白质的分离。
c)特点
优点： 混合物可以达到完全分离，而 且只要电场保持不变，扩散和对流 迁移就不会影响分离的有效性。
缺点： ①.载体两性电解质对产品产生污染； ②.pH梯度的稳定性不高； ③.操作过程中容易发生凝胶脱水起皱现象。 ④.等电点聚焦要求用无盐的溶液，而在无 盐的溶液中蛋白质可能发生沉淀。
电泳分离技术
1971年10月29日因心脏病突发
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 而卒于家中，终年69岁。
电泳特点
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作 用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为 常数，是该带电粒子的物化特征性常数。
4
阿恩·威廉·考林·提塞留斯 提塞留斯是瑞典著名生化学家
和物理化学家。1902年8月10日 出生在斯德哥尔摩，在乌普沙拉 大学获三个硕士和一个博士学位 ，毕业后留校任教。
他改进、设计了电泳仪，成功 地分离了血清中的蛋白质，对氨 基酸和肽也作了分离研究，改进 了色层分离法，他设计的电泳仪 至今还在应用，发展了生物化学 的研究手段，荣获1948年诺贝尔 化学奖。
不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷 相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一 定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分 开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比
6
电荷移动规律
利用电泳可以确定胶体微粒的电性质，向阳极移动的 胶粒带负电荷，向阴极移动的胶粒带正电荷。
一般来讲，金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸 附阳离子，带正电荷；
8
电泳种类I ：
移动界面电泳 是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳
槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电 解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极 （正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其 他离子依电极速度快慢顺序排列，形成不同的区带。 只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其 中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠。
非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子 ，带负电荷。
因此，在电泳实验中，氢氧化铁胶体微粒向阴极移动 ，三硫化二砷胶体微粒向阳极移动。利用电泳可以分 离带不同电荷的溶胶。
电泳分离技术
谢谢
THANKS
样本分析。
电场不均匀性
电泳过程中电场的不均匀性可 能导致分离效果不佳。
高成本
电泳分离技术所需的设备和试 剂成本较高，增加了实验成本
。
操作复杂度
电泳分离技术的操作相对复杂 ，需要专业人员进行操作和维
护。
05 电泳分离技术的发展趋势和未来展望
CHAPTER
技术创新和改进
高效电泳分离技术的研发
通过改进电泳分离技术的原理和工艺，提高分离效率和准确性，降低能耗和成本。
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
细胞分离
利用电泳分离技术可以分离不同种类的细胞，如淋巴细胞 分型、干细胞分离等，为细胞治疗和药物筛选提供支持。
在化学和环境科学领域的应用
有机物分离
电泳分离技术可用于有机物的分 离和纯化，如氨基酸、肽类、糖 类等，在化学合成和药物制备中 具有重要应用。
环境监测
电泳分离技术可用于环境样品中 污染物的分离和检测，如重金属 离子、有机污染物等，为环境监 测和治理提供技术支持。
电泳分离技术
目录
CONTENTS
• 引言 • 电泳分离技术的基本原理 • 电泳分离技术的应用 • 电泳分离技术的优缺点 • 电泳分离技术的发展趋势和未来展望 • 结论
01 引言
电泳分离原理
电泳分离原理
电泳分离原理是一种基于不同物质在电场中迁移速率不同而实现的分离技术。
其基本原理是利用物质在电场作用下的带电性及不同荷质比的差异，通过在一个带电场中对含有混合物的溶液或凝胶进行处理，使其中的成分在电场作用下沿着一定方向迁移，从而实现它们的分离。
电泳分离根据具体的物质性质和条件可以采用不同的方法，常见的有毛细管电泳、凝胶电泳、平板电泳等。
这些方法在电场中运用不同的介质，如液体或凝胶，将需要分离的混合物分散其中，然后通过施加电场，使带电的物质在介质中发生迁移。
迁移的速率取决于物质的特性，如电荷量、荷质比、形状、大小等。
在毛细管电泳中，将待分离的物质溶解在背景电解液中，然后将其注入至两端通电的毛细管中。
施加电场后，带电的溶液分子会在电场力的作用下在毛细管内迁移，迁移速率与物质的荷质比有关。
由于不同物质的荷质比不同，它们在电场中的迁移速度也不同，从而实现分离。
凝胶电泳则是将待分离的物质溶解在凝胶中，通过施加电场使其在凝胶内迁移。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，其主要作用是形成孔隙结构，以便分子在其中迁移。
由于不同物质在凝胶中的迁移速率不同，它们会在电场作用下逐渐分离开来。
总之，电泳分离原理是基于物质在电场中的迁移速率差异实现
的分离技术。
通过控制电场和选择合适的分离介质，可以实现对具有不同特性的物质的高效分离。
第八章电泳分离技术
②聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是亚甲基双丙烯酰 胺交联制备得到的聚合物，具有三维空 间网络结构，结合其对不同大小分子的 筛分效应，可被用来从已知分子量的标 准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准 曲线中测得供试品的分子量。
③琼脂糖凝胶电泳设备与试剂。琼脂糖凝胶 电泳分为垂直型及水平型两种。其中水平型 可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样 都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一 般 用 连 续 缓 冲 体 系 ， 常 用 的 有 TBE ( 0.08mol/L. Tris. HC1, pH8.5 , 0.08mol/L 硼 酸 ， 0.0024mo1/L EDTA) 和 THE(0.04mol/L. Tris. HC1 ， pH7.8 ， 0.2mol/L.醋酸钠，0 .0018mol/L EDTA)。
• 离子的这种障碍效应与其浓度和带电价数相 关，可用离子强度I表示。 • ④电渗。 • 在电场作用下液体对于固体支持物的相 对移动称为电渗( electro osmosis ),其产 生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的 化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负 离子，使溶液相对带负电或正电。
•
• 8.2基本原理 • 带有正电荷的蛋白质分子在电场作 用下向阴极方向移动，而带负电荷的蛋白 质分子向阳极方向移动。蛋白质分子在电 场内迁移所受到的力（F）与电场强度(E) 和蛋白质分子的净电荷数（Z)成正比关系。
• 蛋白质分子在电场中受的力也与溶液黏 度（η）、分子半径(r)及稳态下移动速 度(υ)有以下关系。
• e.脱色与透明。对水溶性染料最普遍应用的 脱色剂是5%醋酸水溶液，将洗净并完全干后 的膜条浸于透明液中10-15min，取出平铺于 洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，为了长 期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋 酸:无水乙醇 = 30：70(体积比)的透明液中。 • f，含量测定。未经透明处理的醋酸纤维素薄 膜电泳图可按各药品项下规定的方法测定， 一般采用洗脱法或扫描法，测定各电泳。 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，其结 构单元是D-半乳糖和3,6一脱水一L-半乳糖， 许多琼脂糖链依氢键及其他力的作用使其互 相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝 胶。因此，该凝胶适合于免疫复合物、核酸 与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在临床生化 检验中常用于LDH , CK等同工酶的检测。
电泳分离
电泳分离法陈庚华武汉科技大学化学工程与技术学院化工学院 11级研究生班201122710002摘要：介绍了电泳分离法的分离原理、影响因素及其分类。
介绍电泳分离法在生物技术方面的应用。
关键词：电泳分离、原理、影响因素、分类、应用电泳(Electrophoresis)是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象。
大分子的蛋白质、多肽、病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸、核苷等在电场中都可作定向泳动。
1937年Tiselius成功地研制了界面电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在U型管的自由溶液中进行的，电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白五种，随后，Wielamd 和Kanig 等于1948年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。
从那时起，电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视，继而发展以滤纸，各种纤维素粉，淀粉凝胶，琼脂和琼脂糖凝胶，醋酸纤维素薄膜,聚丙烯酰胺凝胶等为载体，结合增染试剂如银氨染色，考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力，此外电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量(1ng～0.001ng)水平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。
一、分离原理生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。
常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。
在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。
如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E。
迁移率ｕ=ｖ/E=Q/6πηｒ式中，v为带点粒子的运动速度；η为介质的粘度；r为带点粒子的半径。
因此在一定实验条件下，各种带点粒子的u值是一个定值。
另外，根据离子迁移率的定义，也可以写成ｕ=ｖ/E=(s/t)/(V/L)=sL/Vt式中，V为外加电压；L为两电极间的距离；t为电泳时间；s为带电质点在此时间内的迁移距离。
常规电泳分离技术凝胶电泳
常规电泳分离技术（凝胶电泳）学生：陈瑶学号：10101550121 内容摘要：关键词：电泳分离技术的原理、特点、分类、凝胶电泳的应用范围、应用实例。
一、概念在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。
凝胶电泳：以凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等)为支撑物的区带电泳。
1.主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（1）琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质（2）聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质二、常规电泳分析的原理1.基本原理：在确定的条件下，在电解质溶液中，带电粒子在单位电场强度作用下，带电分子由于各自的电荷和形状大小不同,因而在电泳过程中具有不同的迁移速度,形成了依次排列的不同区带而被分开。
2.这里结合有支持的区带电泳讨论带电的样品颗粒，在饱和缓冲溶液的支持物中，在电场中的运动状态：用Q表示样品颗粒本身所带的电量，用E表示电场强度，V为样品颗粒的移动速度，K表示摩擦系数。
则这时颗粒在电场中所受到拉力（泳动力）为QE，KV彼岸时相反方向的摩擦力，当两种力相等时，可用下式表示：QE=KV ①移动等式①得：V=QE/K ②从②可以得出，颗粒在电场中的移动速度与它的带电量及电场强度的乘积成正比，与摩擦系数成反比。
即颗粒本身携带的电荷越多、电场强度越大，颗粒移动的越快；反之越慢。
再变动一下等式②，即把电场强度移到等式的左边来，得：V/E=Q/K ③式③中的V/E的含义为：在单位电场强度下，颗粒的移动速度，此处称为该颗粒的电泳迁移率，用µ表示，即：µ=V/E=Q/K ④式④中移动速度V用d/t表示，d单位是cm，t的单位是s，即每秒钟移动多少厘米（cm/s）。
电场强度E用V/L表示，V的单位是V，L的单位是cm，L是指电泳支持物的有效长度。
即支持物每厘米长的电位降为电场强度(V/cm)。
例如，在作血清蛋白质的电泳时，支持物醋酸纤维薄膜的有效长度为8cm.电场给予的支持物两端的电压为160V，该电泳的电场强度即为160V、8cm=20V/cm.即支持物每厘米长的电位降为20V。
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显微 电泳
等电聚 焦电泳
等速 电泳
淀粉凝 胶电泳
聚丙烯 酰胺凝 胶电泳
琼脂 糖凝胶 电泳
纸电泳
醋酸纤 维薄 膜电泳
薄层 电泳
薄层电泳
根据支持介质形状不同
分析电泳
板电泳
柱电泳。
用途不同 制备电泳
定量、免疫电泳。
电泳的方向不同
水平电泳 垂直电泳 连续电泳 不连续电泳
电泳系统的连续性
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2)光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照 形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚 合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增 加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除 去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层 水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。
2.1 基本原理
2.1.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合 1)化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵，此外还需 要加速剂TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二 胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的 加入，可使过硫酸铵形成自由基： S2O822SO4-
这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙 . 烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的 聚丙烯酰胺。
（2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。
（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金 属等可抑制聚合反应。
2.1.2 凝胶用量计算
聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小取决于凝胶总浓度 （T% ）和交联度（C%）。
T% = C% =
a+b × 100% m a a+b ×100%
式中a代表单体Arc的重量(g)，b代表交联剂Bis的 重量(g) ，m代表溶液的体积(mL)
样品 浓缩胶 分离胶 缓冲液
缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓 缩效应示意图
快离子 慢离子 蛋白质样品
解离度 ：Cl> 蛋> mclcl>m蛋蛋>m
Gly
Gly
Gly
凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样 品被夹在中间。
凝胶层的不连续性
缓冲液
样品进入浓缩胶有一个 堆积浓缩效应(缓冲液 pH8.3) 蛋白质从“－”极向 “＋”极移动，从浓缩胶 进入分离胶，速度变慢， 堆积浓缩。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作
为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透 明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附 和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。
PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳
1.2.2 两种离子型物质A和B的混合物的分离
dB / t dA / t uA 和 uBuB)
dA dB t E (uA uB )
1.3 电泳技术分类
是否用支持物 用支持物区带电泳 不用支持物电泳
凝胶支 持物区 带电泳
非凝胶 支持 物电泳
缓冲液
浓缩胶 分离胶
1.2 电泳的理论基础
QE f
EQ eZE 6 r 6 r
d u tE E
f 6 r
Q eZ u 6 r 6 r
1.2.1 影响电泳速度的因素
①电场强度： 泳动速度与电场强度成正比； ②溶液的pH值： pH距待分离物质的pI越远， 泳动速度越大； ③溶液离子强度： 离子强度越小,电动势越大, 泳动速度越快； ④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比； ⑤电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物 的相对移动。 ⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越 小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。
2.1.3 分离效应
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为:
连续性电泳
不连续性电泳:凝胶层的不连续性 缓冲液离子成分的不连续性
pH值的不连续性
电位梯度的不连续性
电泳时产生的 3种物理效应: 浓缩效应
电荷效应 分子筛效应
A. 样品的浓缩效应
缓冲液成分及pH的不连续性
浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液 Tris-Gly
表 分离蛋白质选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值
分子量范围 <104 1-4×104 4104-1×105 105-5×105 >5×105
适宜凝胶浓度T% 20~30 15~20 10~15 5~10 2~5
在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分 离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品， 常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的 凝胶浓度。
垂直或平板状电泳
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺(Acr)
-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis) NH2 NH CH2 NH C=O -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CHC=O C=O 聚丙烯酰胺 NH NH2
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH
样品 浓缩胶
分离胶
电位梯度的不连续性
E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动 率最大，在快离子后面形成一 个离子浓度低的低电导区，产 生较高的电位梯度，使蛋白质 和慢离子加速移动，蛋白质样 品被进一步浓缩。
B. 电荷效应
蛋白质样品进入分离胶后， pH增大(pH 8.9)，Gly－解离 度增大，不存在快、慢离子之 分，蛋白质样品在均一电场强 度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载 有效电荷不同，因此质点的有 效迁移率不同，形成不同区带。
第八章 电泳分离技术
主要内容
第一节 概述
第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 等电聚焦电泳 第五节 双向凝胶电泳
第六节 毛细管电泳
1.1 电泳的基本概念
电泳：带电物质在电场中向相反电极
移动的现象。 电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下， 单位时间内质点所移动的距离。 电泳分离技术：利用带电物质在电场中 泳动速度的差别而进行分离的方法。