第八章 印迹技术
分子印迹技术姜义忠
分子印迹技术姜忠义(天津大学化工学院天津 300072)摘要简要综述了分子印迹技术的基本原理和特点分子印迹技术取得的进展和面临的挑战关键词分子印迹分子印迹聚合物The Molecular Imprinting TechniqueJiang Zhongyi(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072)Abstract The basic principle and feature of molecular imprinting technique, the approaches and methods of preparing molecularly imprinted polymers, and the recent developments and challenges of molecular imprinting technique are briefly overviewed. The future development tendency of molecular imprinting technique is simply described.Key words Molecular imprinting, Molecularly imprinted polymers分子印迹技术的出现起源于Pauling在免疫学研究中提出的抗体形成学说[1]ʹ¿¹ÌåÐγÉÓ뿹Ô-·Ö×Ó»¥²¹µÄ¿Õ¼ä¹¹ÐÍ¿Ë¡ѡÔñµ«»¯Ñ§¼ÒÃÇÈ´ÓÉ´ËÊܵ½Æô·¢¶ø·¢Ã÷ÁË·Ö×ÓÓ¡¼£¼¼Êõ1972年Wulff等[3]在高分子聚合物上成功地实现了印迹Mosbach[5]和Whitcombe[6]等在共价分子印迹技术得到了广泛研究和迅猛发展开始召开分子印迹技术的专题学术会议并成立了专门的学术组织仅在1999年研究课题组有70个左右1 分子印迹的基本原理1.1 基本原理当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点记忆当模板分子除去后这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性[8]¸ù¾ÝÄ£°å·Ö×Ӻ;ۺÏÎïµ¥ÌåÖ®¼äÐγɶàÖØ×÷Óõ㷽ʽµÄ²»Í¬36岁副教授 E-mail:zhyjiang@ 2002-01-07收稿2为两类印迹分子先通过较强的共价键与单体结合聚合后再将共价键断裂而去除印迹分子且需用化学方法除去模板分子从而限制了此法的广泛应用印迹分子与功能单体之间预先自组织排列聚合后这种作用保存下来氢键静电引力疏水作用以及范德华力等与共价法相比模板分子易于除去如和等以提供给模板分子更多的相互作用分子印迹技术具有三个特点特异识别性和广泛适用性分子印迹过程机理还缺乏定量和系统的研究分子印迹聚合物(MIPs)对分子的识别源于它与模板分子之间在化学基团以及三维空间结构上的相互匹配Nicholls 等[9]认为相应的自由能变化可通过下式计算Σ并进而改善MIPs 的设计与制备2.1 印迹分子与单体发生相互作用根据单体与印迹分子作用力的类型和大小预测合成带有能与印迹分子发生作用的功能基的单体氨基酸生物碱蛋白质和酶杀虫剂染料等它首先必须能与印迹分子成键常用的共价单体主要有含乙烯基的硼酸或二醇以及含硼酸酯的硅烷混合物等２－乙烯基吡啶2.2 聚合反应在印迹分子和交联剂存在的条件下对单体进行聚合二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)聚合方式有本体聚合原位聚合影响聚合反应的因素包括浓度压力溶剂种类和极性等低温下单体与印迹分子能形成更为有序和稳定的聚合物3由于非共价作用的强弱主要取决于溶液的极性甲苯中进行醇等溶液中进行酸解等物理或化学方法把占据在识别位点上的绝大部分印迹分子洗脱下来3 分子印迹技术的应用现状化学与生物传感器以及催化等方面显示出重要和广泛的应用前景3.1 亲和分离迄今为止膜分离以分子印迹聚合物作为色谱分析固定相早期主要用在液相色谱分离氨基酸及其衍生物后来1986年分离了苯基甘露吡喃糖苷对映体Ｍｏｓｂａｃｈ等[15~17]利用非共价法制备的分子印迹聚合物分离了苯丙氨酸衍生物而后其分离系数达17.8½èÓÃÃâÒßѧÖп¹Ô-¾ö¶¨²¿Î»µÄ¸ÅÄîÖƱ¸³ö¶Ô¶àëĺ͵°°×ÖʾßÓÐÌØÒìÑ¡ÔñÐÔµÄMIPs·ÖÀëϵÊý¿ÉÒÔ´ïµ½4.0以上分离了DMIP 以L-苯丙氨酰苯胺或L-苯丙氨酸为模板分子Allender 等[20]用分子印迹麻黄定聚合物作为色谱固定相来进行(1S,2R)麻黄定和(1R,2S)麻黄定的分离,得到了较高的分离系数和吸附容量建立了血液中2,6-二异丙基苯酚简便将MIPs 应用于膜分离的物质有氨基酸及其衍生物9-乙基腺嘌呤阿特拉津Kobayashi 等[22]采用相转化技术制备了茶碱的MIP 薄膜丙烯酸的共聚物茶碱的吸附量远大于咖啡因MIP 记录下了茶碱分子的形状发现了茶碱和共聚物间相互作用的证据通过N -乙酰-D,L-色氨酸的电渗析实验发现该薄膜对L-异构体有很好的选择性基于分子印迹技术制备的分离膜为分子印迹技术走向规模化和商业化提供了很好的示范易放大的特点基于分子印迹技术的固相萃取代替传统的液液萃取操作简便又可在水溶液中使用这方面的研究报道便相继出现较多苯达松S-萘普生萘心安沙玛尔丁涉及的实验体系主要4有各种生物流体和生物组织(如人狗血清胆汁等)的有机萃取物(氯仿萃取物乙酸乙酯萃取物等)¸ßÑ¡ÔñÐÔʹ¹ÌÏàÝÍÈ¡¿ÉÒÔÓÃÓÚºÛÁ¿·ÖÎö´Ó¶ø¸ÉÈŲⶨµÄ¾«È·¶ÈÐèÒªÖ¸³öµÄÊÇËüÔÚ¼«¶Ë»·¾³(有机溶剂强酸强碱分离过程将显现出明显优势但由于用作分子识别元件的生物活性组分极易变性失活生物活性组分的种类有限现在MIP 已经具备了与自然界中存在的某些天然分子识别系统相似的选择性和亲和力就会使传感器在保持较高的选择性和灵敏度的同时延长寿命糖类医药溶剂和蒸汽等的检测恒电位条件下能选择性地识别吗啡比普通的生物传感器更灵敏同抗体酶一样从而显示酶的活性[32]ÓÃ4-乙烯基咔唑为单体制备出分子印迹聚合物应用聚乙烯咔唑作为印迹聚合物能促进模板分子的酯水解能力所以印迹过渡态类似物成为最普遍的制备模拟酶的方法分子印迹对酶的活性调控也将具有重要作用[33]Morihara 等分别以(R )-和(S )-N -苄基-α-甲苄胺为模板在硅胶表面形成了一个分子印迹的空穴当手性的印迹分子重新结合到有关的空穴上后这说明空穴的手性识别来源于用于印迹空间结构分子印迹聚合物可以作为天然抗体的描述模型由于其物理化学性质稳定Mosbach等用印迹聚合物代替抗体茶碱等[36~38]ÏàËƽṹµÄÒ©ÎïÓн»²æ·´Ó¦·¢Éú·Ö×ÓÓ¡¼£¼¼ÊõÔÚ×éºÏ¿âɸѡ(Combinatorial library screening)Ä¿Ç°·Ö×ÓÓ¡¼£¼¼Êõ´æÔÚMIP结合容量低模板分子发生泄漏等突出问题首先其次交联剂和聚合方法都有很大的经验性和局限性功能单体的种类太少以至于不能满足某些分子识别的要求能用于分子印迹的大多是像药物农药54 展望在未来一段时间(1) 分子印迹和识别过程的机理将从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展(2)合成种类更多提高分子印迹聚合物的吸附 行为和吸附容量(4) 手性分离和固相萃取氨基酸(5) 印迹技术将从氨基酸超分子过渡到核苷酸蛋白质等生物大分子(6) MIPs 用于辅助合成和仿生传感器将获得较快发展随着化学材料学和现代分析技术的不断发展分析和催化等诸多领域发挥越来越大的作用。
8.印迹杂交技术
55
用ASO探针分别与待测DNA进行杂交
只与正常探针杂交-正常纯合子 结果 与正常及突变探针均杂交-杂合子
地高辛标记
18
生物素-11-dUTP
19
异硫氰酸荧光素
罗丹明
荧光素
20
四、探针标记的方法
1.切口平移标记法
2.随机引物标记法 3.PCR标记法
4.末端标记法
21
（一）缺口平移标记法
22
（二）随机引物标记法
23
（三）PCR标记法
以四种dNTP（其中一种为标记dNTP）
为底物，扩增产物即为标记DNA，可作 探针使用，其灵敏度和特异性很高。
上，转移后各待测核酸片段在固相膜 上的相对位置和在凝胶中的相对位置
一样。此过程最重要的是要保持核酸
片段的相对位置不变。
31
固相膜：硝酸纤维素膜、尼龙膜 活化滤纸
印迹方法 毛细管虹吸转移法（毛细转移）
真空转移法 电转移法（电泳转移）
32
（1） 毛细管虹吸转移法
33
（2）真空转移法
34
（3） 电转移法
片段的大小和含量
40
41
第四节 核酸分子杂交的分类
根据杂交核酸分子的种类：
DNA与DNA杂交
DNA与RNA杂交 RNA与RNA杂交
42
根据杂交探针标记的不同： 同位素杂交
非同位素杂交
43
根据杂交介质的不同： 液相杂交 点杂交/狭缝杂交
生物大分子印迹技术
印迹术可用于基因活化的研究。
印迹术被用于各种遗传疾病中功能畸变基因 的分析。
4. 印迹术在生物化学领域的应用
印迹术被广泛应用于各种生物分子间的相互 作用。
Bowen等人，用印迹术研究DNA-蛋白质和 RNA-蛋白质的相互作用。还研究了组蛋白 H2，H3和H4 之间的相互作用。
5.印迹术在生命学科其它领域的应用
1982年，Reinhart 和Malamud将等电点聚焦 法分离蛋白质的凝胶作为印迹模板，他们又把 蛋白质印迹术称为Eastern blotting.
印迹过程及常用术语
凝胶电泳：与常规法电泳相同，但为了使 大分子容易迁出凝胶，常在不影响分辨率 的情况下尽可能采用大孔胶。印迹模板 （Blot templet)放在印迹缓冲液中浸泡，进 行印迹前平衡。
1976年，法国Chambon小组，发现真核生物 基因具有不编码的插入序列。
1977年，Alwine等人将印迹技术应用于RNA 研究上，创建了Northern blotting.
1979年，Towbin等首先把印迹术应用于抗原 检出，并称为免疫印迹术（Immunoblotting）
1981年，Burnette把免疫印迹术称为Western blotting.
印盖于检出 标记物，如抗体、地高辛、同位 素等。经过修饰而打上标记的配体，印迹术 中称为探针（Probe)。
印迹术的评价
1. 湿的固定化纸或膜柔软，容易操作和控制. 2. 被固定于固定化纸或膜表面的生物大分子，
可以均一地和各种配体起反应。 3. 印迹法使生物大分子浓集于固定化纸或膜
表面，提高了依据生物活性或抗原-抗体反应 性的检出灵敏度。 4. 去除变性剂容易，能使生物大分子较完全 地恢复到天然态。
分子印记技术及其应用
三、分子印迹材料的制备方法：
1. 预组装法，共价键法 1972年Wulff G研究小组首 次成功制备出分子印迹聚合物，使这方面的研究产 生了突破性进展。 2. 自组装法，非共价键法 80年代后非共价型膜板 聚合物开始出现，尤其是1993年Mosbach等人有 关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术有 了新的发展，并由此使其成为化学和生物交叉的新 兴领域之一。
3. 将共价作用与非共价作用相结合，应用于置备分 子印迹聚合物（MIPs）。
两种制备方法的比较
结合力
预组装法 可逆的共价 键结合，强 静电引力、 氢键、疏水 作用以及范 得华力等。 其中最重要 的类型是静 电引力 弱
单体
低分子的化 合物 多功能单体
空间结构
精确
反 物理萃取， 专一性不如 共价键法
原理步骤：
（1）在一定溶剂中，膜板分 子（即印迹分子）与含有合 适功能团的单（Functional Monomer）依靠官能团之间 的共价或非共价作用形成主 客体配合物
（3）将聚合物中的印 迹分子洗脱或解离出来。
分子印迹聚合物制备示意图
模板分子
模板分子需要根据所要识别分离的化合物的结构和 性质进行选择； 模板分子可以是低分子化合物、低聚物、金属离子 或金属络合物，也可以是分子聚集体。
Table 4
Enzyme2minic catalyzed reaction on MIPs 参考文献References 121 127 122 127 123 128 124 121 125 96,129
催化反应 Catalyzed reaction 苯甲酸酯的乙酰基转移 Acetyl transferof ethyl 4 氟 4 (对硝基苯基) 丁酮脱 HF benzoate fluorine2(p2nitrobenzyl) butanone HF 催化Diels2Alder 反应 氨基酸衍生物水解 Hydrolysisof an amino acidaction derivativ 2 苯乙酮和苯甲醛的缩合反应 Condensation re 改进固定化钌催化剂的活性和选择性 actoin of acetophenone and benzaldehyde 2 氨基酸的缩合反应 Condensation reaction of 纳米级催化材料的制备 Preparation of nmamino acid catalytic materials 控制枯草溶菌素的活性和选择性能 Controlling aldol condensation 醛醇缩合选择性反应 Selective catalysis of an tivity and selectivityof analysisn
分子印迹技术
分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术,这种技术的基本思想是源于人们对抗体-抗原专一性的认识,利用具有分子识别能力的聚合物材料——分子印迹聚合物(molecule imprinting polymer,MIP)来分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术。
因为制备的材料有着极高的选择性及卓越的分子识别性能,很快在固相萃取、人工酶学、手性拆分、生物传感器、不对称催化等方面得到了广泛的应用。
笔者现主要对MIT在中药提取分离中的应用作一概述。
1 分子印迹技术基本原理及聚合物的制备1.1 基本原理MIT是选用能与印迹分子产生特定相互作用的功能性单体,通过共价或非共价作用在溶剂中形成印迹分子-功能单体复合物,加入交联剂,在引发剂的引发下与带有特殊官能团的功能单体进行光或热的聚合,形成三维交联的聚合物网络,然后,用合适的溶剂除去印迹分子,在聚合物网络中形成空间和化学功能与印迹分子相匹配的空穴。
这种空穴与印迹分子结构完全一样,可对印迹分子或与之结构相似的分子实现特异性的识别。
1.2 分子印迹聚合物的制备分子印迹聚合物的制备过程可分为3步：第一步是印迹,将印迹分子和功能单体按比例混合,使其存在一定的分子间作用力；第二步是聚合,加交联剂,使复合物通过聚合反应形成聚合物；第三步是去除印迹分子,反复洗脱水解,使其形成具有一定空穴的分子印迹聚合物。
根据功能单体和印迹分子间作用力的差异,MIP可分为以下3类。
1.2.1 共价键法也称预先组织法。
印迹分子与功能单体通过可逆的共价键结合,加入交联剂共聚后,印迹分子通过化学方法从聚合物上断开,再用极性溶剂将印迹分子洗脱下来,使其形成具有高密度空腔的分子印迹聚合物。
其主要的反应类型有形成硼酸酯、西佛碱、缩醛(酮)、酯等。
共价键法的优点是空间位置固定,选择性高,峰展宽和脱尾少,常用于诸如糖类、氨基酸类、芳基酮类等多种化合物的特定性识别。
分子印迹技术
分子印迹技术分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT)是20世纪末出现的一种高选择性分离技术,这种技术的基本思想是源于人们对抗体-抗原专一性的认识,利用具有分子识别能力的聚合物材料——分子印迹聚合物(molecule imprinting polymer,MIP)来分离、筛选、纯化化合物的一种仿生技术。
因为制备的材料有着极高的选择性及卓越的分子识别性能,很快在固相萃取、人工酶学、手性拆分、生物传感器、不对称催化等方面得到了广泛的应用。
笔者现主要对MIT在中药提取分离中的应用作一概述。
1 分子印迹技术基本原理及聚合物的制备1.1 基本原理MIT是选用能与印迹分子产生特定相互作用的功能性单体,通过共价或非共价作用在溶剂中形成印迹分子-功能单体复合物,加入交联剂,在引发剂的引发下与带有特殊官能团的功能单体进行光或热的聚合,形成三维交联的聚合物网络,然后,用合适的溶剂除去印迹分子,在聚合物网络中形成空间和化学功能与印迹分子相匹配的空穴。
这种空穴与印迹分子结构完全一样,可对印迹分子或与之结构相似的分子实现特异性的识别。
1.2 分子印迹聚合物的制备分子印迹聚合物的制备过程可分为3步：第一步是印迹,将印迹分子和功能单体按比例混合,使其存在一定的分子间作用力；第二步是聚合,加交联剂,使复合物通过聚合反应形成聚合物；第三步是去除印迹分子,反复洗脱水解,使其形成具有一定空穴的分子印迹聚合物。
根据功能单体和印迹分子间作用力的差异,MIP可分为以下3类。
1.2.1 共价键法也称预先组织法。
印迹分子与功能单体通过可逆的共价键结合,加入交联剂共聚后,印迹分子通过化学方法从聚合物上断开,再用极性溶剂将印迹分子洗脱下来,使其形成具有高密度空腔的分子印迹聚合物。
其主要的反应类型有形成硼酸酯、西佛碱、缩醛(酮)、酯等。
共价键法的优点是空间位置固定,选择性高,峰展宽和脱尾少,常用于诸如糖类、氨基酸类、芳基酮类等多种化合物的特定性识别。
印迹法的基本原理及应用
印迹法的基本原理及应用印迹法(blotting)即转移电泳，是20世纪70年代发展起来的一种新方法。
Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNA-RNA杂交法，称作Southern印迹法。
1977年Alwine等把此方法应用到RNA的研究方面，称作Nouthern印迹法。
1979年Towbin等则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称作Western印迹法。
1982年Reinhart报道的双向蛋白质印迹法，称作Eastern印迹法。
目前，有人把Southern，Nouthern，Western 印迹法分别称作DNA印迹法，RNA印迹法和蛋白质印迹法。
而每一种印迹法又可以分为斑点印迹法和电泳转移印迹法。
前者是将样品直接吸附于固相载体上，而后者则是将样品先经过电泳后在转移到固相载体表面上，其余操作基本相同。
由于核酸和蛋白质等大分子物质印迹到固相载体，容易和各种探针发生化学或免疫反应，因而对检测样品(尤其是粗样品)中某些组分的理化性质是有益的。
其操作过程所需的试剂量少，灵敏度高，所以应用较为普遍。
印迹法的基本原理(一)概念1．探针用化学方法将有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P)，或荧光物质(如异硫氰荧光素、地高辛等)结合成的复合物称作探针。
2．固相载体即用于吸附生命大分子物质的固体材料。
这类材料有硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，尼龙膜(nylon-membranes，NDM)，重氮苄氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether，DPT)纸等。
最常用的是孔径为0．45／lm的NC膜，因为它成本低廉，结合力强，背景较清晰。
而对于检测核酸和酸性蛋白质来说，理想载体是带正电的尼龙膜，它与负电荷物质结合力很强，操作亦简单。
但因为其与负离子型染料也易结合，背景值高，故使用受到一些限制。
生物大分子印迹技术
印迹术的评价
1. 湿的固定化纸或膜柔软，容易操作和控制. 2. 被固定于固定化纸或膜表面的生物大分子，
可以均一地和各种配体起反应。 3. 印迹法使生物大分子浓集于固定化纸或膜
表面，提高了依据生物活性或抗原-抗体反应 性的检出灵敏度。 4. 去除变性剂容易，能使生物大分子较完全 地恢复到天然态。
(e).弃上清，加入原组织液体积的 75％乙醇，用涡 旋振荡器振荡混匀。于4℃ 7500g离心5分钟，弃上 清。
(f).干燥器内干燥RNA沉淀，用不含RNA酶的灭菌水 （DEPC处理的） 溶解RNA，加入1l RNase Inhibitor。用分光光度计测定所得RNA的浓度，冻 存于－70℃。
甲醛电泳
线性化质粒的纯化
对线性化的质粒进行电泳，电泳完毕后，割下含DNA的琼脂 糖，使它尽可能小，放入1.5ml离心管中。注意要尽可能地 去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量和简化操作有好处； 按每100 mg琼脂糖加入300～600 l S1液的比例加入S1液， 置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混 匀一次。如果琼脂糖重量小于100 mg，用ddH2O 补充至 100 mg，以确保总体积不至太小；加入1/3 S1液体积的异丙 醇，混匀，55℃温浴1分钟；将溶化的Agarose液移入吸附 柱，离心1分钟，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同 一收集管中；在吸附柱中加入450 l W1 液，静置1分钟后， 离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管 中；在吸附柱中加入450 l W1 液，离心15秒，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；离心1分钟；将吸 附柱放入一个干净的1.5 ml 的RNase-free的离心管中，在吸 附膜中央加入20 l DEPC处理的ddH2O液，4℃ 5小时或过 夜，离心1分钟；取1l电泳检测。将1.5 ml的离心管（DNA） 储存于－20℃。
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印迹杂交过程
⒈ 样品制备→⒉ 电泳分离→⒊ 印迹→⒋ 预杂交→ ⒌ 杂交→⒍ 洗膜→⒎ 分析
固相支持物
• • • • 电泳用的凝胶不能直接做支持物 将核酸分子结合于表面 有较好的机械强度 常用硝酸纤维膜和尼龙膜
几种转膜方法：
（1）毛细管虹吸转移法
吸水纸 NC膜或尼龙膜 滤纸 转移缓冲液 玻璃板 重物（500g）
滤纸
凝胶
支持物
上行毛细管转移
（2）电转移
①一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行） ②单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进行碱 变性，随后中和，再转移 ③特点：转移快，2-3小时即可；
（3）真空转移
使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。
电转移法
真空转移法
预杂交
• 固相膜可结合DNA，包括探针。 • 封闭固相膜上多余的结合位点。 • 常用非特异性的DNA或蛋白质。
微量点样法 原位合成法
探针设计与制备 支持物预处理
探针打印
探针固化 DNA芯片 杂 交 与 漂 洗 扫 描 与 分 析
显微光蚀刻/压电打印/分子印章
样品准备
核酸提纯
扩增与标记
标记核酸纯化
① 基因芯片制备
就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针， 通过一定的方法固定到固相支持物上。
主要有两种：原位合成法和直接点样法
影响杂交的因素
• • • • • 杂交温度， 离子强度 DNA和探针浓度 杂交促进剂，聚乙二醇 杂交时间
常用核酸杂交分类 杂交方法
Southern印迹
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA分子, 需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA分子, 需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和 噬菌体中释放的DNA分子
四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法 操作： NC膜拓印培养的菌落 原位裂解菌落，释放DNA 预杂交 杂交 结果分析 从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落
用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落 或噬菌斑
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
菌 落 杂 交
五、核酸原位杂交（组织原位杂交） 概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并 对其实行检测的方法，称为核酸原位 杂交（nucleic acid hybridization in situ) 用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位； 研究细胞特定基因表达水平；确定组织 有无病原体感染等。
DNA限制片段
（b）
（ c）
（d）
硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的 基因DNA片段 X光底片
（ e）
DNA印迹杂交的主要步骤
• • • • 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 印迹（转膜）： – 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测
(双向电泳蛋白质印迹技术)
Southern blotting 用于分析DNA
核酸分子杂交基本原理
• 核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列 的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配 对原则形成双链的过程。 （固相和液相杂交）
变性
复性
探针(probe)
杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序 列，通常把已知的核酸序列称作探针（probe）。 • 探针(probe)，是指与待测的分子发生特异性相互 作用，并可被特殊的方法探知的分子。 • 除了核酸探针外，探针利用抗体-抗原、生物素抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用的原理 与靶分子结合。
核酸探针应具有的条件： • 带有标记物； • 单链； • 高度特异性； • 检测方法应简单，灵敏度；
核酸探针的种类
• • • • 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
核酸探针标记物 分为放射性标记探针和非放射性标记探针两 大类
1、放射性同位素 应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影。 优点：灵敏度高； 缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。
免疫印迹（Western blotting)
将待测蛋白质 （抗原）变性
电泳
转移到 NC膜上
封闭
加入 抗体
加入标记 的二体
显示 区带
检测
检测分析
应用举例
• 基因芯片与中医寒证的7类相关基因 对典型寒证而且用热药有明显疗效者， 尝试用基因芯片筛选出59条差异表达基因 表达谱（涉及到7类基因），探索寒证所涉 及的相关基因类别。
原位合成法和直接点样法的比较
② 样品制备
——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污 染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。
常用标记物： 生物素 荧光素 对照样品（Cy5-dUTP） 待测样品（用Cy3-dUTP 标记）
待测样品用 Cy3，发射 562nm红色 荧光
• 方法： 精选对其治疗有明显疗效的典型寒证 病例，在治疗前后分别采外周血，提取血 液中的mRNA，再逆转录为cDNA以备检 测。采用2035条人的靶基因cDNA制备成 基因表达谱芯片。用两种荧光物质分别标 记治疗前与治疗后cDNA，用其制备成探 针与表达谱芯片进行杂交。
结果：
初步筛选出了差异表达基因59条，涉 及到与能量代谢、糖代谢、脂记的
3’ 5’ 切口原始位置
切口最终位置
32P标记的DNA
单链DNA片段
DNA切口平移标记法
随机引物法（random
priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具 有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）
末端标记法
• DNA末端末端标记法只是将DNA片段的一 端（5’端或3’端）进行部分标记。由于标记 活性不高，标记物掺入率低，一般极少用 做核酸分子杂交探针标记。
末端标记法
探针的纯化
• 目的：除去游离的标记dNTP • 方法：乙醇沉淀、凝胶过滤
核酸印迹杂交技术原理和流程
（a）
基因组DNA
技术过程
1 2
支持物
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
放 射 自 显 影 照 片
二、RNA印迹法（Northern bloting）
操作：与DNA印迹相似 RNA经变性后再电泳， 凝胶中加甲醛保持RNA单链。
用途：检测mRNA、检测基因表达情况
Northern印迹杂交
• 是一项用于检测特异性RNA的技术。
原位杂交
蛋白质印迹法
• Western 印迹法（Western bloting）分析 蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为 免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法 • 用途： 鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检 测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。
• 典型的印迹过程包括三个步骤 ①蛋白质的电泳分离； ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜 上，用非特异性，非反应活性分子封闭固 体膜上未吸附蛋白质区域； ③免疫学检测。
DNA凝 胶电泳
blotting
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
变性
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Southern印迹杂交法
内切酶
基因组DNA
重物 纸巾 10×SSC 转移缓冲液 500g
1 2 M
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
5’ 3’ 变性 3’ 随机引物 3’ Klenow片段α-32P-dNTP 3’
3’ 5’ 双链DNA
5’ 单链DNA 5’
5’
变性
32P标记的单链
DNA探针
DNA的随机引物标记法
PCR标记法
• 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标
记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的 同时掺入到新合成的DNA链上。
2、非放射性标记物
生物素：
一种小分子水溶性维生素，
连接在碱基上，
和抗生物素蛋白（avidin）特异结合， 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 地高辛： 一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测， 原理类似于生物素的检测。
核酸探针的制备
• 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷 酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随 机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法 标记探针
Northern印迹
斑点杂交
菌落杂交和噬斑杂交
原位杂交
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、DNA印迹法（Southern bloting ） 将电泳分离的待测DNA片段转移并结 合到一定的固相支持物上，然后用标记的 DNA探针检测待测DNA的一种方法。 用途：检测目的DNA的存在，基因突变
Southern
RNA凝 胶电泳
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Northern Blot
β-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达(Northern
杂交)
三、斑点印迹 操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品 变性后点在干的NC上，与探针杂交。 用途：检测DNA样品同源性、细胞内特 定基因拷贝数；mRNA的相对含 量。