质粒载体构建

附录A 表达载体的构建

1、大肠杆菌质粒DNA的提取（SDS碱裂解法）

该方法参照分子克隆指南的方法修订而成。

细胞的制备

(1) 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。

(2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。

(3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

细胞的裂解

(4) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。

(5) 加200μl新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与碱裂解液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

(6) 加150μl用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。

(7) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。

(8) 加等量体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。

质粒DNA的回收

(9) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸。振荡混合，于室温放置2min。

(10) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，收集沉淀的核酸。

(11) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。

(12) 加1ml 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的离心管颠倒数次，用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，回收DNA。

(13) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。

(14) 将开口的离心管置于室温使酒精挥发，直至离心管内没有可见的液体存在（5-10min）。

(15) 用50μl含有去DNA酶的RNA酶A（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，温和几秒钟振荡，贮存于－20℃。

2、质粒DNA的酶切、回收与连接

质粒DNA的酶切

(1) 提取的质粒DNA用相应的酶进行酶切。

酶切体系为：

单酶切双酶切

ddH2O 8μl ddH2O 8μl

质粒DNA 10μl 质粒DNA 10μl

10×buffer 2μl 10×buffer 2μl

限制性内切酶Ⅰ0.4μl 限制性内切酶Ⅱ0.4μl

限制性内切酶Ⅲ0.4μl 混匀，简单离心后，37℃水浴反应2-4h。

酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

(2) 单酶切需要用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）去除质粒DNA两端的磷酸基，以防止自身环化。

①酶切产物纯化。取酶切产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，回收沉淀，用预冷的70%酒精洗涤沉淀2次，倒置风干，用25μl TE Buffer溶解。

②CIAP的去磷酸反应。

DNA 25μl

ddH2O 19μl

10×AP buffer 5μl

CIAP 1μl

混匀，简单离心后，37℃反应1h。

③去磷酸产物纯化。取去磷酸产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，弃上清，倒置风干，用20μl 以下的TE Buffer溶解。

质粒DNA的回收

采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0进行凝胶回收。

(1) 对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的

DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

(2) 切碎胶块。称量胶块重量，以重量:体积1:3(1mg=3μl)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(3) 均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。胶块一定要充分融化，否则严重影响DNA回收率。

(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。

(5) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6) 将上述操作(4)的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

(7) 将500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。

(8) 将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。

(9) 重复操作步骤(8)。

(10) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。

(11) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μl的预热至60 ℃灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。

(12) 12000 rpm离心1 min洗脱DNA，4 ℃保存备用。

质粒DNA的连接

将酶切回收的目的片段DNA和载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物可直接转化大肠杆菌。

连接体系：

PEG4000 1μl

Vector 0.5μl

DNA 5.5μl

10×ligase buffer 2μl

T4 DNA ligase 1μl

先将Vector和DNA混合好，置于45℃水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入其他成分，混匀，简单离心后，置16℃过夜。

3、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）

全过程都要在冰上进行，且动作尽量要轻

(1) 从37℃培养16-20h的平板中挑取单菌落，转到5ml LB液体培养基中，