[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞
胚胎干细胞的培养
胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES cell)也称ES细胞,是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。
全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。
胚胎干细胞能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。
胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。
由于其具有全能性,故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。
例如在培养液中加入不同的分化因子,可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞,甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞,或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶,经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内,并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。
从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。
由于胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
目前, 由于小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，本文将以此为例，较详细地介绍胚胎干细胞体外分离培养和鉴定等实验技术。
一、胚胎干细胞体外培养原理胚胎干细胞体外培养的原则是: 在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。
胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。
有饲养层培养法主要应用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层(feeder layer)，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。
胚胎干细胞的培养和调控
胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。
它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。
为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。
第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。
营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。
经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。
胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。
无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。
营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。
2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。
3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。
此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。
4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。
第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。
在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。
胚胎干细胞的培养与应用
胚胎干细胞的培养与应用随着科学技术的不断进步，胚胎干细胞已经成为了当今医学研究的热门话题。
那么，什么是胚胎干细胞呢？胚胎干细胞是从受精卵发育而来的一类全能分化干细胞，具有极高的发展潜能和可塑性，能够不断分化为各种不同类型的细胞。
在医学上，胚胎干细胞被广泛应用于组织修复、疾病治疗等方面。
一、胚胎干细胞的培养1. 胚胎干细胞的提取胚胎干细胞的来源主要是人类受精卵和早期胚胎组织。
实际上，胚胎干细胞的提取违反了一些伦理原则，因为需要拆卸一个活生生的胚胎。
因此，在国际上，提取胚胎干细胞的过程和规范都有非常严格的要求。
2. 胚胎干细胞的培养和分化提取到的胚胎干细胞需要进行培养，以维持其生长和发育。
目前，利用培养基、小鼠胚胎等条件进行体外培养的方法比较常见。
培养基中含有不同浓度的各种细胞因子，可以促进胚胎干细胞不断分化为不同类型的细胞。
目前，科学家们已经成功培育出一些实验用的胚胎干细胞系，并利用这些细胞系进行了一些基础研究和实验。
二、胚胎干细胞的应用1. 组织修复胚胎干细胞具有不同类型的分化潜能，能够分化为各种类型的细胞，如心肌细胞、神经细胞、肝细胞等。
这些细胞可以重新修复和再生人体各种组织和器官，包括心脏、脑部、肝脏等。
因此，利用胚胎干细胞实现组织修复已成为医学领域的重要研究方向。
2. 疾病治疗利用胚胎干细胞进行疾病治疗是另一个重要的应用领域。
某些细胞如神经细胞等无法自我修复，其损伤导致的疾病无法治愈。
此时，胚胎干细胞通过分化成相应类型的细胞，能够重新修复并替代受损细胞，从而实现治疗。
例如，利用胚胎干细胞治疗糖尿病、帕金森病等疾病的研究已经有了一些初步进展。
三、胚胎干细胞研究面临的挑战和展望1. 伦理问题胚胎的提取和胚胎干细胞的研究一直是一个伦理和道德问题争议的焦点。
因此，正确认识和解决这些问题，将有助于推动胚胎干细胞研究的发展。
2. 法律法规目前，国际上对胚胎干细胞培育和应用的法律法规比较不一致，这也给胚胎干细胞研究和应用带来了一定的不确定性和局限性。
关于培育技术中胚胎干细胞培养与鉴定的实用指南
关于培育技术中胚胎干细胞培养与鉴定的实用指南培育技术中胚胎干细胞培养与鉴定的实用指南胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）作为一种多能干细胞，具备不同类型细胞的分化潜力，因而在医学和生物科学研究中具有重要的应用价值。
然而，要成功培育和鉴定胚胎干细胞是一项复杂的工作。
本文将为你提供一份关于培育技术中胚胎干细胞培养与鉴定的实用指南，帮助你更好地进行相关研究。
第一部分：胚胎干细胞培养技术胚胎干细胞培养的成功与否对于其后续的鉴定具有重要影响。
在进行胚胎干细胞培养时，有几个关键要点需要注意。
首先，选择适当的培养基和生长因子是关键因素之一。
培养基必须提供细胞所需的营养物质、氨基酸和生长因子等。
通常，胚胎干细胞的培养基包括DMEM/F12、KnockOut DMEM以及特定的补充物如胰岛素、转铁蛋白等。
生长因子如FGF-2和TGF-β可以促进细胞增殖和分化，因此在培养基中添加适量的生长因子可以增加胚胎干细胞的培养成功率。
其次，培养条件和技术操作也十分重要。
胚胎干细胞需要在无菌的环境中培养，对培养器具、介质和操作者的无菌要求较高。
同时，需要控制培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等，以维持细胞的正常生长。
定期更换培养基、细胞子域以及进行细胞的分级传代等操作也是必要的。
第二部分：胚胎干细胞鉴定技术胚胎干细胞的鉴定是为了确认细胞群体中是否存在纯化的胚胎干细胞。
常用的胚胎干细胞鉴定方法主要包括形态学观察、免疫染色和基因表达分析等。
首先，形态学观察是一种简单直观的鉴定方法。
胚胎干细胞呈现出无定型的、高度可塑的形态，具有较高的核质比，胞质内含有较多的碱性磷酸酶等。
其次，免疫染色技术可以检测特定蛋白在细胞中的表达情况。
常用的免疫染色标记物包括Oct4、Sox2、Nanog等，它们在胚胎干细胞中高度表达。
通过免疫染色可以观察到这些蛋白在细胞中的定位和表达情况，从而判断细胞是否为胚胎干细胞。
最后，基因表达分析可以通过检测特定基因的表达水平来鉴定细胞类型。
胚胎干细胞和多能诱导干细胞培养方法
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胚胎干细胞体外培养.
胚胎干细胞体外培养.胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES 细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤
利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，简称ESCs）是一种具有无限分裂潜能的细胞，可以分化成人体中任何类型的细胞。
这使得胚胎干细胞培养成为研究和治疗许多疾病的潜在方法。
在利用培育技术进行胚胎干细胞培养的操作步骤中，有几个关键的步骤是必须仔细考虑和执行的。
首先，需要获取胚胎。
这个过程通常是通过体外受精(In Vitro Fertilization，简称IVF)完成的。
医生会收集女性的卵子和男性的精子，然后将它们结合在一起，在实验室环境中进行体外受精。
这一步骤要确保卵子和精子的质量，并控制好培养环境的温度和湿度。
接下来，受精后的卵子会不断分裂，形成胚胎。
为了获取胚胎干细胞，最常用的方法是在胚胎发育到八细胞阶段时，将其分离成单个细胞。
这个过程被称为细胞扩增(Cell Expansion)。
细胞扩增的关键是确保每个细胞的健康和稳定性。
细胞扩增过程中，常常需要添加培养基和生长因子，以促进细胞的分裂和生长。
当细胞扩增到一定数量时，就可以开始进行胚胎干细胞的分化。
分化过程通常涉及将胚胎干细胞移植到特定的培养基中，并加入适当的生长因子和细胞信号转导分子。
这些因子和分子可以模拟人体内特定发育时期的信号，从而促使胚胎干细胞向特定种类的细胞分化。
例如，通过添加一种叫作“Noggin” 的蛋白质，胚胎干细胞可以被诱导分化为神经细胞。
分化的结果取决于培养的时间和添加的生长因子，以及其他培育条件的调节。
通过对胚胎干细胞的培养和分化过程进行精确控制，研究人员可以获得一系列不同类型的细胞，包括心脏细胞、肝细胞、胰岛细胞等。
这些特定的细胞类型可以应用于研究、药物测试和再生医学等领域。
需要注意的是，胚胎干细胞培养涉及许多伦理和法律问题。
在进行胚胎干细胞研究和应用时，必须确保遵守伦理准则和法律规定，保护人类生命和尊严。
总结来说，利用培育技术进行胚胎干细胞培养涉及从胚胎获取细胞、进行细胞扩增和细胞分化的过程。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
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[胚胎干细胞培养标准化操作规程]培养胚胎干细胞胚胎干细胞培养标准化操作规程6/28/01目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1、表达绿色荧光蛋白的B5-ES细胞。
由Dr、 Nagy的实验室制备。
2、D3-ATCC; CRL-1934、我们得到时大约传了17代。
3、J1-由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。
我们得到时大约传了7－9代。
4、J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr、 Jaenish的实验室友情提供。
5、表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr、 Nagy的实验室提供。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO的高糖培养基来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液。
分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和ESGRO 加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液马血清L-谷氨酰胺MEM NEAAHEPESβ-巯基乙醇PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1、从液氮中取出一管细胞；2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟；3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；4、加入5ml ES培养基；5、离心3分钟；6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7、接种在明胶包被的6孔或6cm组织培养皿；8、孵育。
冻存细胞90％HS和10％二甲基亚砜步骤：1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2、用细胞刮刀收集细胞；3、将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中5、分装于冻存管内，每管1ml；6、置－80℃过夜，第二天移入液氮。
明胶包被准备500ml ％明胶溶液1、将明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中。
2、最好在溶液没有冷却的情况下通过μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面；2、置室温30分钟；3、去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。
纯化步骤包含在下面的方法中。
1、去除培养液；2、1×无钙镁PBS洗涤；3、加入1×胰酶EDTA37℃孵育5分钟。
4、加入ES培养基使胰酶失活；5、将细胞转入15ml离心管中离心3min；6、去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。
ES 细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。
这样可能会减少细胞的自然分化。
7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中放入温箱2小时；8、将含有细胞的培养基转入明胶包被的组织培养皿。
吹打以确保细胞被分散开9、建议按1：4－1：10的比率传代保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。
当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
体外分化多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择，在有bFGF存在的情况下扩增并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
时间线第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天培养基EB配制一20×不含DMEM，FBS，ESGRO的溶液。
分装在50ml FALCON管中，，贮存在-20℃。
将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液DMEM胎牛血清L-谷氨酰胺MEM NEAAHEPESβ-巯基乙醇PEST，μm滤膜过滤，贮存在-20℃。
将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液DMEM转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮腐胺PEST层粘连蛋白100μg/ml纤维连接蛋白250μg/ml碱性rhFGF,10μg/ml*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮腐胺PEST层粘连蛋白纤维连接蛋白碱性rhFGF,包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板包被液的准备多聚-L-鸟氨酸，15μg/ml把75ml多聚-L-鸟氨酸和425ml1×PBS混合。
贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml把纤维结合蛋白和500ml1×PBS混合。
包被过程：1、加入多聚-L-鸟氨酸，至少2－3小时2、吸出多聚-L-鸟氨酸3、加入纤维结合蛋白，大约1－2小时4、吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干5、贮存在4℃24孔板用200μl，6孔板用500μl。
震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。
有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法第1步：ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养第2步：EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1、分散纯化细胞2、纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon 管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3、用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4、一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞。
5、2天后更换培养基将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6、用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步--ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1、在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2、并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3、保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培养基＋bFGF通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
洗涤，加入2ml1×胰酶2、37℃孵育5分钟3、用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4、将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5、将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上。
24孔板接种×105/孔或6孔板×106/孔。
6、2天后更换培养基第5步－N3培养基通过撤除bFGF使神经前体细胞分化1、细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基2、根据需要换液3、分化10～15天后固定细胞移除培养基PBS洗涤加入4%福尔马林室温放置30分钟PBS洗涤2次储存于PBS。
长期储存使用含％叠氮化纳的PBS移植细胞的准备细胞在胚状体形成4天以后被移植。
正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。
通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植1、将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
细胞被离心3分钟会更好。
放置使之沉降将会去除更多的单个细胞而这些细胞可以被离心下来。
2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中3、离心3分钟4、去除上清加入1×胰酶5、37℃水浴5分钟6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。
7、离心2分钟8、吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10、离心2次11、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基烟酸己可碱标记ES细胞进行移植1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液2、加入1mg到5ml EB培养基3、将溶液稀释成10μg/ml4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液，5、将悬液置于室温30分钟6、离心2分钟7、吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基8、重复一次9、离心2分钟10、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。